提升耐热性的植酸酶制造技术

本申请系关于一种提升耐热性的植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A至D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合C系将序列编号2第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。

Phytase capable of improving heat resistance

This application relates to enhance the heat resistance of phytase, the amino acid sequence for sequence number 2 mutation combination A to one of D series, the A series will be combined mutation sequence number 2 143rd and 262nd amino acids mutated to cysteine (Cysteine), B sequence mutation combinatorial number 2 259th and 312nd amino acids mutated to cysteine (Cysteine), C sequence mutation combinatorial number 2 205th and 257th amino acids mutated to cysteine (Cysteine), and the combination of D sequence mutation number 2 264th and 309th amino acids mutated to cysteine (Cysteine).

【技术实现步骤摘要】
提升耐热性的植酸酶本申请系关于一种植酸酶，尤指一种提升耐热性的植酸酶。现有技术植酸(phyticacid)又称为肌醇六磷酸(myo-inositol(1,2,3,4,5,6)hexakisphosphate)，为植物中储存磷的主要形式，在种子中含量尤其丰富，而种子如谷类及豆类是动物饲料的主要原料。虽然种子中的植酸可成为饲养动物所需磷的重要来源，但只有反刍动物才能代谢植酸以利用其中的磷；对于非反刍动物，不能被消化代谢的植酸反而被视为抗营养物质，是因为植酸带有丰富的负电，易与带有正电的离子，如钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铜离子、铁离子螯合，再与蛋白质及淀粉形成复合物，阻碍消化酵素代谢，影响营养物质及金属离子的消化吸收。此类无法代谢植酸的非反刍动物须在饮食中添加无机磷或添加植酸酶。但添加无机磷的方式不仅成本高，动物排泄物中未被代谢的植酸也会造成水质污染，破坏生态平衡。经由植酸酶在饲料中的添加，则可增加动物对饲料中磷的可利用性达到60％，降低磷酸的抗营养现象，除了提高营养吸收，也能降低磷的排出达50％。植酸酶是能够从植酸中水解出磷酸根的酵素泛称，在动物、植物、微生物中皆可找到植酸酶基因的存在，植酸酶能够将植酸上的六个磷酸根依序水解出来，不同植酸酶的水解最终程度不一，水解机制也不同，若依此做为分类，植酸酶可分为组氨酸酸性磷酸酶(histidineacidphophatase)、紫色酸性磷酸酶(purpleacidphosphatase)、β螺旋桨植酸酶(β-propellerphytase)，以及半胱氨酸磷酸酶(cysteinephytase)，其中组氨酸酸性磷酸酶因为其最适pH值及作用条件较适合用于饲料添加，因此被广泛的研究。组氨酸酸性磷酸酶催化机制是藉由酸碱反应，将连接肌醇环及磷酸根的磷酸单脂键进行水解作用，释放出磷酸根；水解步骤分为两个阶段，首先组氨酸酸性磷酸酶会利用活性区的组氨酸攻击植酸中的一个磷酸单脂键，形成磷酸-组氨酸中间体，再由活性区的天冬氨酸利用一个水分子提供质子给磷酸-组氨酸中间体中磷酸根的氧离子，释放出一个磷酸根。尽管植酸酶于饲料添加在动物饲养已显示增加生产力，且使用500-1000单位活性的植酸酶可代替1克的的无机磷添加及减少30-50％磷的排出，但在工业上如何使占有饲料市场60％的植酸酶能具有经济效益，为酵素改造持续的目标及需求。植酸酶在饲料工业的制程及应用上，必须具有在pH2-6.5高活性，抗酸性及抗胃蛋白酶及抗胰蛋白酶分解的特性，产品制粒时的耐热性，提高酵素作用时的活性才能降低生产成本。酵素改造的策略可分为两种，一是利用定向进化，一是利用理论性的设计。定向进化包括两个步骤，一是制造具有丰富多样性的突变基因库，其次再从基因库中筛选具有特定优化特性的突变株。突变基因库的制造方法常用的有易错聚合酶链式反应(error-pronePCR)及DNA重组反应(DNAshuffling)，但庞大的突变基因库需要有大量筛选的方法，否则对于筛选上是相当耗费人力及时间的。近年来，随着可利用的蛋白质结构及序列增加，还有计算机计算软件技术的发展，蛋白质中与底物结合、活性区域、稳定结构的氨基酸可被识别出，因此以此理论基础建立的突变基因库能更有效地筛选出优化的酵素特性。在比较耐热性蛋白质和适温性蛋白质结构的研究，可观察酵素结构与耐热性的关系，耐热性蛋白质有较多的氨基酸侧链和侧链间氢键及盐桥的键结。另外，藉由一连串于T4溶解酵素(T4lysozyme)做的突变蛋白质结构与特性分析，发现增加疏水核心的稳定性、加强局部氢键及盐桥的连结、使用双硫键稳定结构等可增加蛋白质耐热性。越来越多的研究运用计算机软件仿真计算以提高蛋白质的耐热性，突变蛋白质结构可藉由计算机软件分析建立起一套参数，再将参数运用在增加其他目标蛋白质的耐热性，缩小筛选稳定结构的改造点及键结的范围。因此，本申请欲藉由改造基因以增加植酸酶之双硫键键接，藉此提升植酸酶对于温度的耐受性，以有效增加植酸酶在工业上应用的产业价值。
技术实现思路
本申请之目的在于改造现有植酸酶，利用结构分析及定点突变技术，增加植酸酶之双硫键键接，以有效提升植酸酶之耐热性，进而增加植酸酶之工业应用价值。为达上述目的，本申请之一较广义实施态样为提供一种植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A至D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合C系将序列编号2第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。编码该序列编号2之基因系从大肠杆菌(Escherichiacoli)所分离出来并经优化的AppA基因，且该植酸酶系为组氨酸酸性磷酸酶。在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号24所示。在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号26所示。在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号28所示。在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号30所示。本申请之另一较广义实施方案为提供一种植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A以及合并突变组合B及D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号32所示。在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号34所示。附图说明图1显示植酸酶AppA的核苷酸序列以及氨基酸序列。图2显示植酸酶AppA的蛋白质立体结构及改造点的位置。图3显示定点突变所用的引子。图4显示改造后之AppA-A植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图5显示改造后之AppA-B植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图6显示改造后之AppA-C植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图7显示改造后之AppA-D植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图8显示改造后之AppA-A+B植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图9显示改造后之AppA-A+D植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图10显示AppA与AppA加上不同双硫键突变组合的耐热分析测试。具体实施方式体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本申请能够在不同的实施方案上具有各种的变化，其皆不脱离本申请的范围，且其中的说明及图式在本质上系当作说明之用，而非用以限制本申请。本申请中的植酸酶基因(EcAppA)是从大肠杆菌(Escherichiacoli)所筛选出来的，其所表现的蛋白酶为组氨酸酸性磷酸酶。EcAppA有许多符合工业应用的特质如：高活性、高度底物专一性、最适作用pH范围、以及在工业生产菌株毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达量高等。为提高饲料制粒后的植酸酶活性，需提高EcAppA的耐热性，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A至D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合C系将序列编号2第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。

【技术特征摘要】
1.一种植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A至D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合C系将序列编号2第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。2.如权利要求1所述之植酸酶，其中编码该序列编号2之基因系从大肠杆菌(Escherichiacoli)所分离出来并经优化的AppA基因。3.如权利要求1所述之植酸酶，其中该植酸酶系为组氨酸酸性磷酸酶。4.如权利要求1所述之植酸酶，其中该植酸酶之氨基酸序列如序列编号24所示。5.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭瑞庭，陈纯琪，郑雅珊，吴姿慧，黄建文，赖惠琳，林正言，柯宗佑，
申请(专利权)人：东莞泛亚太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44