基于阻断物的富集系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于PCR的系统和富集少数等位基因和突变的方法，包括在一个或者多个阻断物存在的条件下用一条正向引物和一条反向引物扩增靶区域。该方法可以高灵敏度地检测核酸突变，某些情况下最低检测限(LOD)可达0.01％‑0.001％，该方法可以富集或检测各种感兴趣的靶核酸，可以用于在癌症早期检测、手术或放化疗后残留病变的评估、疾病分期以及用于预后的分子分析、监测治疗结果和癌症的缓解或复发等方面。

Enrichment system based on blocking substance and its application

The invention discloses a PCR system and the enrichment of minority alleles and mutation based methods, including amplification of target region with a forward primer and a reverse primer in the presence of one or more blocker conditions. This method can highly sensitive detection of nucleic acid mutation, the lowest detection under certain circumstances limit (LOD) of up to 0.01% 0.001%, this method can detect various target nucleic acid enrichment or interest, can be used in the early detection of cancer, surgery or chemotherapy residual disease, disease staging and prognosis assessment for the molecular analysis, monitoring the treatment results and cancer remission or relapse.

【技术实现步骤摘要】
基于阻断物的富集系统及其应用
本申请涉及基因突变检测
，具体而言，涉及一种基于PCR的系统和少数等位基因和突变的富集方法。
技术介绍
检测核酸突变或变异对包括疾病检测和预后在内的各种情况都非常重要。涉及临床和诊断应用的一个突出关注是能检测到临床上非常重要的低水平的突变和少数等位基因。在很多方面，能够区分突变非常重要，对于下列情况尤为如此：从组织活检和体液如血浆或者血清进行癌症早期检测；术后或者放疗、化疗后对残留病灶的评估；疾病分期和用于预后的分子分析或者根据不同病人使用不同的治疗方案；对治疗结果、癌症缓解和复发进行监测等。对癌症相关的体细胞突变的有效检测在很大程度上取决于所选用的技术和方法。检测和鉴定致癌基因突变和肿瘤抑制基因突变主要是分析癌前或者癌组织，痰，尿液，粪便和释放到血液中的循环胞外DNA。样本通常包括野生型和突变型DNA，野生型DNA经常超过所述突变DNA贡献的量。在许多情况下，野生型DNA大大超过突变DNA，使检测和鉴定极低浓度的少数等位基因非常困难。因而现阶段亟需用于富集少数等位基因和突变的系统和方法。基于建立用于少数等位基因和突变的富集的系统和方法的必要性，本专利技术因此而来。
技术实现思路
本申请旨在提供一种富集少数等位基因和突变的系统和方法，以解决现有技术中的问题。为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种核酸分子组合物，用于富集在目标核酸的靶核酸序列的等位基因突变，可以满足上述少数等位基因和突变检测和鉴定少数等位基因和突变的需要。在一个方面，本专利技术提供了一种核酸分子组合物，用于富集在目标核酸的靶核酸序列的等位基因突变，包括：(a)能够扩增靶核酸序列的正向引物和反向引物和(b)包括第一段序列的第一阻断物，此序列满足下述要求(i)和靶核酸序列的野生型等位基因相匹配或互补和(ii)能够被DNA聚合酶延伸。该组核酸分子可以进一步包括第二阻断物，此阻断物含有与野生型等位基因的互补基因相匹配或者互补的第二段序列。在一些实施方案中，第一阻断物或第二阻断物不与任一所述正向引物或反向引物重叠。在其它一些实施方案中，第一阻断物或第二阻断物可以包含一个或多个修饰的核酸或键。在第一阻断物或第二阻断物还可以有在3'末端修饰的核酸或键。所述的修饰的核苷酸或键可以包括PNA，LNA，2’-O-甲基核酸，2’-O-烷基核酸，2’-荧光标记核酸，硫代磷酸酯键和它们的任意组合。在一些实施例中，靶核酸序列覆盖编码EGFRT790M(EGFRExon20)、EGFRL858R(EGFRexon21)、EGFRexon19del、BRAFV600E、BRAFV600K、BRAFV600D、BRAFV600G、BRAFV600A、BRAFV600R，或者表8和9中列出的任意一个突变的区域。正向或者反向引物长度可以是在10-50个核苷酸之间，比如约15-30，约16-28，约17-26，约18-24，或者约为20-22个核苷酸。第一阻断物或第二阻断物长度可以约是5-100个核苷酸，例如，约10-50，约15-30，约16-28，约17-26，约18-24，或约为20-22个核苷酸。在优选的实施方案中，一般来说，阻断物比引物要短。本专利技术还提供了包括如上所述的核酸分子组合物，用于扩增反应的一个或多个试剂的试剂盒。该试剂盒可以包括一种或多种选自缓冲剂，DNA聚合酶，RNA酶抑制剂，延伸核苷酸(extensionnucleotides)和探针组成的试剂。本专利技术还提供了一种用于富集靶核酸序列的等位基因突变的方法。该方法包括提供一种如上所述的核酸分子组合物；在第一或者第二阻断物存在的条件下用正向引物和反向引物扩增靶核酸序列。该富集方法可以用于检测靶核酸序列中是否存在等位基因突变。此方法包括如上所述的富集等位基因突变用于制备扩增产物；和检测扩增产物中是否存在等位基因突变。该检测步骤可以通过基因测序或者本领域中已知的其他技术来进行。靶核酸序列可覆盖编码EGFRT790M、EGFRL858R、EGFRexon19del、BRAFV600E、BRAFV600K、BRAFV600D、BRAFV600G、BRAFV600A、BRAFV600R，或者表8和9中列出的任意一个突变的区域。其中表8为：表9为：所述的富集方法也可以用于评估患有癌症受试者或怀疑患有癌症(例如，肺癌和黑色素瘤)的受试者。这样的评价方法，包括：首先从所述受试者获得生物样品；然后进行检测以确定一个或多个等位基因突变是否存在于上述生物样品中。在一个实例中，癌症是肺腺癌，如非小细胞肺癌。该生物样品可以是血清，血浆，全血，唾液或痰。该方法还可以包括根据上述的一个或者多个等位基因突变的存在来确定或推荐一个治疗疗程。该方法还可以包括：当所述一个或多个等位基因突变存在时，在治疗疗程中进行给药的步骤。本专利技术的一个或多个实施例的细节在下面的实施例描述中阐述。其它特征、目的以及本专利技术的优势将通过说明书和/或权利要求书展示。本专利技术的详细描述本专利技术基于或者至少部分地基于一个意外的发现，即与特定核苷酸突变(如野生型突突变)匹配或者互补的寡核苷酸阻断物(第一阻断物和/或第二阻断物)能阻断或者抑制特定的核酸突变的扩增，从而允许其它突变(例如，突变变体)的富集。因此本专利技术还可以提供一种富集这些突变反应的系统和用于检测的目标区域的核酸突变是否存在的方法。反应系统在一些实施方案中，本专利技术的富集反应系统包括引物，阻断物和PCR扩增所必需的成分。如图2A-C中所示，本专利技术的系统具有：(i)第一阻断物，此阻断物能结合或者杂交到与正向引物结合的同一条链或者序列中；和(ii)第二阻断物和反向引物能结合或杂交到相反链和/或互补序列中。引物对(即一条正向引物和一条反向引物)用于扩增含有热点突变的区域，而阻断物用于阻止核酸突变的扩增(例如一种丰富的等位基因突变如野生型等位基因)。阻断物是与核酸突变(例如野生型等位基因)互补的寡核苷酸，其3'端被设计成与感兴趣的突变完全匹配。例如，它完全与野生型等位基因退火，能被DNA聚合酶延伸。熔解温度与寡核苷酸的长度高度相关。通过延长阻断物的长度，阻断物能承受较高的反应温度，并保持与野生型等位基因的结合。另一方面，在初始的低反应温度下，阻断物也可以与突变等位基因退火；然而，因为突变等位基因的突变碱基并不与阻断物的3'端匹配，延伸无法进行。一旦温度升高，这导致阻断物从突变型等位基因解离。因此，阻断物紧密地与野生型结合而容易与突变变性，引物得以在反应中扩增感兴趣的区域。因为阻断物与野生型退火，引物延伸不能继续通过封锁区域，因此突变等位基因被优先扩增。例如如图2A所示，阻断物和野生型等位基因退火，延伸的阻断物阻止了外引物的PCR扩增。图2B中，每一个阻断物在3’端都有错配所以无法保持对突变等位基因的结合，所以可被外引物扩增。在图2C中，非特异性延伸只导致了整个特定模板的等位基因在这一个循环的扩增失败，结果无假阳性PCR产物形成。本文所公开的系统优于等位基因特异性PCR(AS-PCR)，也被称为扩增阻滞突变系统(amplificationmutationrefractorysystem，ARMS，参考NewtonC,GrahamA,HeptinstallL,etal.Analysi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于富集靶核酸序列的等位基因突变的组合物，其特征在于所述组合物包括：一对包括正向引物和反向引物的引物对，用于特异性扩增靶核酸序列；第一阻断物，包含具有以下功能的第一段序列：(i)和靶核酸序列的野生型等位基因匹配或者互补；(ii)能够被DNA聚合酶延伸。

【技术特征摘要】
2016.10.14 CN 20161089818701.一种用于富集靶核酸序列的等位基因突变的组合物，其特征在于所述组合物包括：一对包括正向引物和反向引物的引物对，用于特异性扩增靶核酸序列；第一阻断物，包含具有以下功能的第一段序列：(i)和靶核酸序列的野生型等位基因匹配或者互补；(ii)能够被DNA聚合酶延伸。2.权利要求书1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括第二阻断物，包括第二段序列，其与野生型等位基因的互补基因匹配或者互补。3.权利要求书1或者2所述的组合物，其特征在于，其中第一阻断物或者第二阻断物不与正向引物或者反向引物有重叠。4.权利要求书1或者2所述的组合物，其特征在于，第一阻断物或者第二阻断物包含一个或者多个修饰核酸或者键；优选的，第一阻断物或者第二阻断物在3‘端具有一个或者多个修饰核酸或者键；优选的，其中修饰核酸或者键包括PNA，LNA，2’-O-甲基核酸，2’-O-烷基核酸，2’-荧光标记核酸，硫代磷酸酯键和它们的任意组合。5.权利要求书1或者2所述的组合物，其特征在于，其中靶核酸序列覆盖编码EGFRT790M、EGFRL858R、EGFRexon19del、BRAFV600E、BRAFV600K、BRAFV600D、BRAFV600G、BRAFV600A、BRAFV600R或者表8和9中列出的任意一个的区域；其中表8为：表9为：6.权利要求书1或者2所述的组合物，其特征在于，所述正向引物长度为10-50个核苷酸，反向引物长度为10-50个核苷酸；第一或者第二阻断物长度为5-100个核苷酸。7.一种试剂盒，包括：权利要求书1-4中任意一项所述的组合物；和一种或多种扩增反应所需的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡光辉，丁崴，何新军，赵洪玉，孙德斌，黄隽，
申请(专利权)人：苏州艾达康医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32