The invention discloses a construction of a BRCA1/2 Library of gene detection method and kit, the method comprises the following steps: in the repair of the reaction system and terminal fragment of DNA, in the end, repair interrupted enzyme enzyme, DNA fragment and end repair sample homogenization; in the DNA connection under the action of the enzyme, the a step of the product is connected with the joint sequence; one step above the joint connection products as template, in under the action of DNA polymerase, PCR primer using joint sequence; using the probe sequence containing BRCA1/2 gene and a step of the product was hybridized to capture BRCA1/2 gene containing DNA fragment, and elution to obtain hybrid capture products; in ligase, the single hybrid capture product realization, by detection of BRCA1/2 gene library. The method of the database construction of the invention is simple and fast, effectively reduces the cost and reduces the workload, and the variation type is comprehensive, accurate and high in flux.
【技术实现步骤摘要】
一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
,尤其涉及一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法和试剂盒。
技术介绍
根据国家癌症中心在《临床医师癌症杂志》上公布的2015年癌症统计数据,中国妇女卵巢癌年发病5.21万例,年死亡2.25万例,死亡率约为43%,为妇科三大肿瘤之首。乳腺癌年发病27.2万例,年死亡7.07万例,死亡率约为26%。另外,美国癌症学会研究显示,I型乳腺癌的患者5年生存率达到88%,IV型乳腺癌的5年生存率只有15%,这说明级别越高,生存率越低;发现越早,生存率越高。因此,采用合理的预防措施对于乳腺癌及卵巢癌的“早发现,早诊断,早治疗”具有重要意义。随着人类基因密码的解开,愈来愈多的疾病被发现与遗传因子有关,尤其对于癌症而言,遗传物质的差异对疾病的发生率、疾病的临床过程、以及对不同治疗的反应程度都将有一定程度的影响。基因作为遗传信息的记录体和传递者可以反映出个体肿瘤的遗传携带情况并用于评估个体易感风险。BRCA1/2是两种具有抑制恶性肿瘤发生的基因,在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。目前在ESMO及NCCN指南中对于乳腺癌和卵巢癌高危人群进行BRCA1/2基因检测均有推荐。据文献报道,约有5%~10%的乳腺癌和10~18%的卵巢癌是由生殖系BRCA1/2突变引起的。据统计,约有50%的遗传性乳腺癌和90%的遗传性卵巢癌有生殖细胞上的BRCA1突变;约有40%的遗传性乳腺癌和5%~10%的遗传性卵巢癌伴有BRCA2的突变。在家族遗传性乳腺癌和/或卵巢癌患者亲属 ...
【技术保护点】
一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法,其特征在于,包括:(1)在DNA片段化及末端修复反应体系中,在打断酶、末端修复酶的作用下,将均一化的DNA样本片段化并末端修复;(2)在接头连接体系中,在DNA连接酶的作用下,将步骤(1)所得的产物与接头序列连接;(3)以步骤(2)所得的接头连接产物为模板,在DNA聚合酶的作用下,使用接头序列的引物进行PCR扩增;(4)使用包含BRCA1/2基因的探针序列与步骤(3)的产物进行杂交以捕获含有所述BRCA1/2基因的DNA片段,并洗脱以获取杂交捕获产物;(5)在单链环化体系中,在连接酶的作用下,使所述杂交捕获产物的单链实现环化,得到所述BRCA1/2基因检测文库。
【技术特征摘要】
1.一种BRCA1/2基因检测文库的构建方法,其特征在于,包括:(1)在DNA片段化及末端修复反应体系中,在打断酶、末端修复酶的作用下,将均一化的DNA样本片段化并末端修复;(2)在接头连接体系中,在DNA连接酶的作用下,将步骤(1)所得的产物与接头序列连接;(3)以步骤(2)所得的接头连接产物为模板,在DNA聚合酶的作用下,使用接头序列的引物进行PCR扩增;(4)使用包含BRCA1/2基因的探针序列与步骤(3)的产物进行杂交以捕获含有所述BRCA1/2基因的DNA片段,并洗脱以获取杂交捕获产物;(5)在单链环化体系中,在连接酶的作用下,使所述杂交捕获产物的单链实现环化,得到所述BRCA1/2基因检测文库。2.根据权利要求1所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法,其特征在于,所述接头序列带有用于区分不同DNA样本的条形码序列,每一所述条形码序列对应一种DNA样本;相应地,在步骤(3)之后,将来源于多个DNA样本的所述步骤(3)的PCR扩增产物混合在一起并纯化,以用于步骤(4)中的杂交捕获。3.根据权利要求1所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法,其特征在于,在步骤(4)和步骤(5)之间,还包括:(4’)以步骤(4)所得的杂交捕获产物为模板,在DNA聚合酶的作用下,使用接头序列的引物进行PCR扩增,以增加所述杂交捕获产物的量。4.根据权利要求1-3任一项所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法,其特征在于,所述末端修复酶包括:Klenow片段、Taq酶和T4多聚核苷酸激酶;任选地,所述打断酶为DNA片段化酶。5.根据权利要求1-3任一项所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法,其特征在于,所述接头序列按照5’端至3’端的顺序如下所示:长链序列:AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAANNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA(SEQIDNO:1),其中NNNNNNNNNN表示所述条形码序列;短链序列:TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQIDNO:2);相应地,所述接头序列的引物按照5’端至3’端的顺序如下所示:上游引物:GAACGACATGGCTACGA(SEQIDNO:13);下游引物:TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQIDNO:14)。6.根据权利要求1-3任一项所述的BRCA1/2基因检测文库的构建方法,其特征在于,步骤(4)的杂交之前先使用阻断序列对步骤(3)的产物进行处理,以阻断非特异性结合;优选地,所述...
【专利技术属性】
技术研发人员:李红梅,叶明芝,李世勇,苏孟媛,
申请(专利权)人:深圳华大基因股份有限公司,天津华大医学检验所有限公司,广州华大基因医学检验所有限公司,华大生物科技武汉有限公司,
类型:发明
国别省市:广东,44
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