一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法技术

本发明专利技术属于黄曲霉毒素B1的定量检测领域，公开了一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，利用纳米金标记黄曲霉毒素的核酸适配体，通过黄曲霉毒素B1单克隆抗体、核酸适配体与目标物黄曲霉毒素B1结合，形成具有夹心式结构的单克隆抗体‑黄曲霉毒素B1‑检测探针复合物，具有更强的特异性，与待测物中的目标分子结合效果好，检测结果更加精确、定量检测范围更广，具有体积小、成本低、操作简单的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法
本专利技术属于黄曲霉毒素B1的定量检测领域，具体涉及一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法。
技术介绍
黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物。目前已鉴定分离出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ1和AFH1等十多种黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，简称AFB1）的毒性和致癌性最强。AFB1的强毒性、高致癌性以及存在的广泛性，对人类健康安全和畜牧业等造成了严重的威胁，因此开发黄曲霉毒素B1的高灵敏检测方法是国内外关注的热点。核酸适配体是一段寡聚核苷酸，功能与抗体相似，能够特异性结合靶目标分子，凭借其与抗体相比的众多优点吸引了研究人员的广泛关注，如低成本、高稳定性、易修饰、易合成、不需要活体动物或细胞、可重复利用等。家用便携式血糖仪能够对血糖进行准确的测量，并且具有体积小、成本低和操作简单的特点，成为预防糖尿病的有用工具，是很多家庭的医疗必备品。但它们只能对单一目标物血糖（葡萄糖）进行检测，难以应用于不同类型目标物的检测，这大大限制了这些便携式仪器即时检测的应用范围。怎样利用血糖仪检测非糖靶目标，吸引了研究人员的关注。目前可分离定量检测AFB1的方法主要有薄层色谱法，高效液相色谱法，液相色谱-串联质谱法以及免疫分析方法。这些方法大多需要体积庞大、价格昂贵的检测设备，并且操作步骤繁琐，检测周期长，不利于现场即时检测。因此，开发一种基于血糖仪检测黄曲霉素B1的方法，实现对黄曲霉素B1这一非糖靶目标的快速简单、高灵敏度检测，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，通过抗体、核酸适配体同时与目标物结合，具有更强的特异性，与待测物中的目标分子结合效果好，检测结果更加精确、定量检测范围广，具有体积小、成本低、操作简单的特点。为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，包括以下步骤：步骤一：制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物；步骤二：将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，4℃孵育12h；用缓冲液B冲洗；然后加入封闭缓冲液，室温封闭1h；用缓冲液A冲洗，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的固定；步骤三：向步骤二的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体中加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用缓冲液A冲洗未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体；步骤四：在步骤三所得的结合体中加入步骤一制备的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，37℃孵育2h，形成具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物，未与结合体上的黄曲霉毒素B1结合的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物留在上层上清液中；步骤五：取步骤四的上清液，加入蔗糖溶液，37℃孵育30min后，用血糖仪进行定量检测。进一步地，所述制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的步骤如下：a）将蔗糖酶加入到胶体金中混合，4℃孵育6h，得到纳米金-蔗糖酶复合物；b）向黄曲霉毒素B1的核酸适配体中加入TCEP试剂，室温，黑暗条件下，反应2h激活黄曲霉毒素B1的核酸适配体；c）将步骤b）激活后的黄曲霉毒素B1的核酸适配体加入到步骤a）的纳米金-蔗糖酶复合物中，在振荡培养箱中50r/min、37℃孵育16h，形成纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物；d）将步骤c）的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物离心，取出上清液，先用少量的缓冲液A冲洗沉淀物，再用缓冲液A溶解沉淀物，室温涡旋震荡5min，得到纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针，并在4℃保存。进一步地，所述黄曲霉毒素B1的核酸适配体的核苷酸序列为：5’-SH-AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。进一步地，所述缓冲液A的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液A包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl。进一步地，所述缓冲液B的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液B包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl；缓冲液B中吐温-20的质量百分数为0.05%。进一步地，所述封闭缓冲液包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，牛血清白蛋白；封闭缓冲液中牛血清白蛋白的质量百分数为1%。进一步地，所述胶体金中金颗粒的直径为20nm。进一步地，所述TCEP试剂的浓度为2.5mmol/L，PH为5.0。进一步地，所述蔗糖酶浓度为2mg/ml。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术采用胶体金作为标记物，因为胶体金能稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变，它可以作为探针对细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肤、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位；同时胶体金具有以下特点：使用方便快速，便于基层使用和现场使用成本低，不需要特殊的仪器设备；应用范围广，可适应多种检测条件，可以进行多项检测，多项检测可以节省样品；降低成本，标记物稳定，标记样品在4℃贮存两年年以上，无信号衰减现象；2.传统的检测大分子物质的方法，都是单一利用抗体与目标物结合，或是核酸适配体与目标物结合，从而间接测出目标物的量，而本专利技术中形成了具有夹心式结构的单克隆抗体-目标物（黄曲霉毒素B1）-检测探针复合物，通过抗体、核酸适配体同时与目标物结合，具有更强的特异性，且与待测物中的目标分子结合效果更好，通过检测上清液中剩余的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的量，得到较强的血糖仪信号值，使得检测结果更加精确、定量检测范围更广；3.本专利技术利用家用便携式血糖仪进行检测，相比利用传统的大型检测设备，具有体积小、成本低和操作简单的特点，可为日常生活、生产等方面提供一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法，保障食品安全。附图说明图1是本专利技术一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法的检测原理流程图。图2是本专利技术血糖仪信号值与检测黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线图。图3是本专利技术血糖仪信号值与检测黄曲霉毒素B1浓度的线性关系图。图4是本专利技术检测不同类型的毒菌毒素的特异性曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步陈述，但并非是对本专利技术保护范围的限定，实施例中所涉及的工艺方法，如无特别说明则为常规方法或步骤，所用药品试剂除特别说明外，均为市售。本专利技术所涉及到的术语，除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。胶体金（colloidalgold）：也称金溶胶（goldsolution），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuCl2-），外层离子层H+则本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：制备纳米金‑蔗糖酶‑核酸适配体检测探针复合物；步骤二：将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，4℃孵育12h；用缓冲液B冲洗；然后加入封闭缓冲液，室温封闭1h；用缓冲液A冲洗，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的固定；步骤三：向步骤二的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体中加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用缓冲液A冲洗未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体；步骤四：在步骤三所得的结合体中加入步骤一制备的纳米金‑蔗糖酶‑核酸适配体检测探针复合物，37℃孵育2h，形成具有夹心式结构的单克隆抗体‑黄曲霉毒素B1‑检测探针复合物，未与结合体上的黄曲霉毒素B1结合的纳米金‑蔗糖酶‑核酸适配体检测探针复合物留在上层上清液中；步骤五：取步骤四的上清液，加入蔗糖溶液，37℃孵育30min后，用血糖仪进行定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物；步骤二：将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，4℃孵育12h；用缓冲液B冲洗；然后加入封闭缓冲液，室温封闭1h；用缓冲液A冲洗，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的固定；步骤三：向步骤二的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体中加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用缓冲液A冲洗未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体；步骤四：在步骤三所得的结合体中加入步骤一制备的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，37℃孵育2h，形成具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物，未与结合体上的黄曲霉毒素B1结合的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物留在上层上清液中；步骤五：取步骤四的上清液，加入蔗糖溶液，37℃孵育30min后，用血糖仪进行定量检测。2.根据权利要求1所述的利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的步骤如下：a）将蔗糖酶加入到胶体金中混合，4℃孵育6h，得到纳米金-蔗糖酶复合物；b）向黄曲霉毒素B1的核酸适配体中加入TCEP试剂，室温，黑暗条件下，反应2h激活黄曲霉毒素B1的核酸适配体；c）将步骤b）激活后的黄曲霉毒素B1的核酸适配体加入到步骤a）的纳米金-蔗糖酶复合物中，在振荡培养箱中50r/min、37℃孵育16h，形成纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物；d）将步骤c）的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体混合物离心，取出上清液，先用少量的缓冲液A冲洗沉淀物，再用缓冲液A溶解沉淀物，室温涡旋震荡5min，得到纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜利英，刘帅，任林娇，张培，齐汝宾，王延峰，郑晓婉，陈青华，姜素霞，
申请(专利权)人：郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：河南,41