一种景天属植物的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种景天属植物的遗传转化方法。本发明专利技术首先保护一种景天属植物的遗传转化方法，依次包括如下步骤：(1)取景天属植物的茎段，诱导丛生芽形成，得到分生组织块；(2)取步骤(1)得到的分生组织块，与重组农杆菌进行共培养；所述重组农杆菌是将具有目的DNA分子的质粒导入出发农杆菌得到的；(3)取步骤(2)得到的分生组织块，诱导生芽；(4))取生芽的分生组织块，诱导生根。本发明专利技术提供的方法，具有遗传转化率高的优点，对于景天属植物的遗传转化以及基因工程研究，具有重大的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一种景天属植物的遗传转化方法
本专利技术涉及一种景天属植物的遗传转化方法。
技术介绍
镉(Cd)对所有的有机体都具有严重的毒害作用。目前我国土壤镉污染形式严峻，且有逐年加重的趋势。土壤中的镉具有很强的迁移能力，很容易被植物吸收，并通过食物链进入人体，严重危害人们的身体健康。植物修复(Phytoremediation)是治理镉等土壤重金属污染的一种理想途径。近年来研究较多的镉超富集植物有鼠耳芥、遏蓝菜、东南景天和伴矿景天。镉超富集植物同时也是锌的超富集植物。相对其它镉超富集植物来说，伴矿景天具有镉富集能力强，生物量大等特点(CaoD,ZhangHZ,WangYD,ZhengLN(2014)Accumulationanddistributioncharacteristicsofzincandcadmiuminthehyperaccumulatorplantsedumplumbizincicola.B.Environ.Contam.Tox.93,171-176.)。近年来，关于伴矿景天在镉污染土壤植物修复中的研究较多，种植伴矿景天7年之后，土壤中Cd含量降低了87.8％(DengL,LiZ,WangJ,LiuHY,LiN,WuLH,HuPJ,LuoYM,ChristieP(2016)Long-termfieldphytoextractionofzinc/cadmiumcontaminatedsoilbySedumplumbizincicolaunderdifferentagronomicstrategies.Int.J.Phytoremediat.18,134-140.)。目前利用镉超富集植物进行镉污染土壤的植物修复需要长期大量的投资，很难实现大规模商业化应用。关于伴矿景天的研究只停留在小规模的试验阶段，还很难以实际应用。因此，培育具有经济效益的超富集工程植物对镉污染土壤的持续性植物修复具有重要意义。深入研究伴矿景天等超富集植物镉富集和解毒的分子机制，挖掘镉富集相关基因，进而可以为获取镉超富集的工程修复植物提供理论基础和基因元件。若要进行伴矿景天基因功能的研究，前提是能够对其进行基因操作。建立超富集植物的遗传转化体系是揭示这类特殊生境植物对重金属吸收、转运分子机理的关键手段。而且，伴矿景天只对镉锌具有高抗性和超富集能力，但对其它重金属如砷铜汞等却不具有超富集和高抗性。如果能够实现伴矿景天遗传转化，将会极大地促进植物对镉超富集分子机制的研究和相关功能基因的挖掘，并且可以获取对多种重金属复合污染具有抗性和修复能力的伴矿景天工程植物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种景天属植物的遗传转化方法。本专利技术首先保护一种景天属植物的遗传转化方法，依次包括如下步骤：(1)取景天属植物的茎段，诱导丛生芽形成，得到分生组织块；(2)取步骤(1)得到的分生组织块，与重组农杆菌进行共培养；所述重组农杆菌是将具有目的DNA分子的质粒导入出发农杆菌得到的；(3)取步骤(2)得到的分生组织块，诱导生芽；(4)取生芽的分生组织块，诱导生根。步骤(1)中，所述诱导丛生芽形成是在芽诱导培养基上进行的；所述芽诱导培养基为如下(a1)、(a2)或(a3)：(a1)含有6-BA和NAA的培养基；(a2)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(a3)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基。步骤(1)中，诱导丛生芽形成的培养时间可为3-6周。步骤(1)中，诱导丛生芽形成的过程中，每周继代一次，均采用芽诱导培养基。步骤(1)中，诱导丛生芽形成的培养条件具体可为：25℃，14小时光照/10小时黑暗。步骤(1)中，茎段的制备方法具体如下：取景天属植物的茎，灭菌后纵向切成茎段。每个茎段具有1个茎节。每个茎段的长度为1厘米左右。灭菌的方法具体如下：用自来水冲洗干净→用75％(体积比)酒精水溶液消毒30s→用无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干→用0.1g/100mLHgCl2水溶液浸泡6分钟(期间轻轻摇动)→用无菌水至少冲洗4次后用无菌滤纸吸干。步骤(1)中，诱导丛生芽形成后，选择生长状况良好、丛生芽密集成团(>40个/茎节)的茎段组织块，切除丛生芽的叶片，并进一步将丛生芽切成块(1cm左右小块)，即为分生组织块。所述质粒上具有潮霉素抗性基因。所述潮霉素抗性基因具体可为潮霉素磷酸转移酶基因(HPT基因)。所述质粒具体可为pSN1301质粒。所述质粒具体可为在pSN1301质粒的多克隆位点插入目的DNA分子得到的重组质粒。所述出发农杆菌为根癌农杆菌，具体可为根癌农杆菌C58。步骤(2)中，分生组织块用侵染液侵染后进行共培养。所述侵染液为含有所述重组农杆菌的液相。所述侵染液的OD600nm具体可为2.0。所述侵染液具体可为用含100μMAS的MS液体培养基重悬所述重组农杆菌菌体得到的液相。所述侵染具体可为室温浸泡30min(每隔2-3min震荡一次)。步骤(2)中，所述共培养是在共培养培养基上进行的。所述共培养培养基具体可为如下(d1)、(d2)或(d3)：(d1)含6-BA、2,4-D和AS的培养基；(d2)含0.5mg/L6-BA、1.5mg/L2,4-D和100mg/LAS的培养基；(d3)含0.5mg/L6-BA、1.5mg/L2,4-D和100mg/LAS的MS固体培养基。步骤(2)中，共培养的条件具体可为：25℃暗培养3天。步骤(3)中，所述诱导生芽是在筛选培养基上进行的；所述筛选培养基为如下(b1)至(b9)中的任意一种：(b1)含有6-BA和NAA的培养基；(b2)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(b3)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基；(b4)含有潮霉素、6-BA和NAA的培养基；(b5)含有20mg/L潮霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(b6)含有20mg/L潮霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基；(b7)含有潮霉素、头孢霉素、6-BA和NAA的培养基；(b8)含有20mg/L潮霉素、600mg/L头孢霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(b9)含有20mg/L潮霉素、600mg/L头孢霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基。步骤(3)中，诱导生芽的培养时间可为：培养至苗茎高达到1cm。步骤(3)中，诱导生芽的培养条件具体可为：25℃，14小时光照/10小时黑暗。步骤(3)中，诱导生芽的过程中，每周继代一次，均采用筛选培养基。步骤(4)中，所述诱导生根是在根诱导培养基上进行的；所述根诱导培养基为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)含有潮霉素和头孢霉素的培养基；(c2)含有30mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的培养基；(c3)含有30mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的MS固体培养基。步骤(3)中，诱导生根的培养条件具体可为：25℃，14小时光照/10小时黑暗。步骤(3)中，诱导生根的过程中，每周继代一次，均采用根诱导培养基。本专利技术还保护一种制备景天属植物的分生组织块的方法，包括如下步骤：取景天属植物的茎段，诱导丛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种景天属植物的遗传转化方法，依次包括如下步骤：(1)取景天属植物的茎段，诱导丛生芽形成，得到分生组织块；(2)取步骤(1)得到的分生组织块，与重组农杆菌进行共培养；所述重组农杆菌是将具有目的DNA分子的质粒导入出发农杆菌得到的；(3)取步骤(2)得到的分生组织块，诱导生芽；(4)取生芽的分生组织块，诱导生根。

【技术特征摘要】
1.一种景天属植物的遗传转化方法，依次包括如下步骤：(1)取景天属植物的茎段，诱导丛生芽形成，得到分生组织块；(2)取步骤(1)得到的分生组织块，与重组农杆菌进行共培养；所述重组农杆菌是将具有目的DNA分子的质粒导入出发农杆菌得到的；(3)取步骤(2)得到的分生组织块，诱导生芽；(4)取生芽的分生组织块，诱导生根。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述诱导丛生芽形成是在芽诱导培养基上进行的；所述芽诱导培养基为如下(a1)、(a2)或(a3)：(a1)含有6-BA和NAA的培养基；(a2)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(a3)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述诱导生芽是在筛选培养基上进行的；所述筛选培养基为如下(b1)至(b9)中的任意一种：(b1)含有6-BA和NAA的培养基；(b2)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(b3)含有0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基；(b4)含有潮霉素、6-BA和NAA的培养基；(b5)含有20mg/L潮霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的培养基；(b6)含有20mg/L潮霉素、0.1mg/L6-BA和1.0mg/LNAA的MS固体培养基；(b7)含有潮霉素、头孢霉素、6-BA和NAA的培养基；(b8)含有20mg/L潮霉素、600mg/L头孢霉素、0.1mg/L6-BA和...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐文忠，刘桓，赵海霞，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11