一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法、制备的传感器及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法、制备的传感器及应用，将碱性磷酸酶溶液投入到过量的L‑抗坏血酸‑2‑磷酸溶液中，然后将混合物置于碱性缓冲溶液中共同孵育，生成L‑抗坏血酸；加入双蒸水、石墨烯量子点和硝酸银溶液进一步混合孵育；银纳米粒子逐步沉积在石墨烯量子点表面，石墨烯量子点表面的荧光强度逐步降低，石墨烯量子点表面沉积的银纳米粒子的吸光度逐渐增加；根据荧光强度或吸光度的变化，进行碱性磷酸酶活性的定量检测。本发明专利技术可以通过肉眼对目标物碱性磷酸酶进行可视化鉴别，也可用比色法和荧光法对碱性磷酸酶进行定量检测。双重模式的检测通过两种方法输出测定结果，减小了环境波动引起的误差，保证了测定结果的可靠性。

Method for detecting alkaline phosphatase activity based on double mode of fluorescence and colorimetric, preparation of sensor and Application

The invention discloses a method and application of sensor based on fluorescence and colorimetric detection of alkaline phosphatase activity of double mode of preparation, the alkaline phosphatase solution into excess L ascorbic acid 2 phosphoric acid solution, and then were placed in a mixture of alkaline buffer solution was generated L ascorbic acid; adding double distilled water, graphene quantum dots and silver nitrate solution further mixed incubation; silver nanoparticles gradually deposited on graphene quantum dot surface, the fluorescence intensity of the graphite surface graphene quantum dots gradually reduced, the absorbance of graphene quantum dots deposited on the surface of silver nanoparticles increased gradually; according to the change of fluorescence intensity or absorbance, quantitative detection of alkaline phosphatase activity. The invention can visually identify alkaline phosphatase of the target through naked eyes, and can also quantitatively detect alkaline phosphatase by colorimetric method and fluorescence method. Double mode detection outputs the measurement results by two methods, which reduces the error caused by environmental fluctuations and ensures the reliability of the measurement results.

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法、制备的传感器及应用
本专利技术涉及一种碱性磷酸酶的活性检测方法，尤其涉及的是一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法、制备的传感器及应用。
技术介绍
碱性磷酸酶(ALP)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。这些酶在信号转导、细胞内过程的调控包括细胞周期，生长，凋亡和信号转导通路中起着举足轻重的作用。因此，碱性磷酸酶一直被视为重要的生物标志物。正常血清碱性磷酸酶水平在20～140U/L之间，异常的碱性磷酸酶水平可能会导致一系列的疾病包括乳腺癌、前列腺癌、骨疾病、糖尿病和肝功能疾病。因此，寻找一个方便和灵敏的分析方法对碱性磷酸酶活性进行实时监测是迫切需要的。到目前为止，已经报道多种检测碱性磷酸酶活性的分析方法包括比色法，化学发光，电化学方法，表面增强共振拉曼散射方法和荧光法。在这些分析方法中，比色法和荧光法检测具有灵敏度高、高效率、高通量、可直接测量和不需要任何先进仪器等优点已经成为一个有吸引力和有前途的候选方法。石墨烯量子点(GQDs)，石墨烯家族的一个新成员，最近发现其属于一类零维石墨复合材料分为单层、双层和多层，伴随着横向尺寸小于100nm。与传统半导体材料量子点相比，石墨烯量子点表现出优异的化学惰性，易于生产以及展现出低的细胞毒性和良好的的生物相容性。另外，值得一提的是，由于量子约束和边缘效应，石墨烯量子点展现出较高的光致发光和缓慢的热载流子弛豫，使它们的性质不同于传统的石墨烯片。石墨烯量子点的上述优点使其在化学催化、药物输送系统、传感器和成像等领域有着广泛的应用前景。然而，石墨烯量子点的应用发展仍处在初始阶段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法、制备的传感器及应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术的一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：(1)制备石墨烯量子点；(2)将碱性磷酸酶溶液投入到过量的L-抗坏血酸-2-磷酸溶液中，然后将混合物置于碱性缓冲溶液中共同孵育，生成L-抗坏血酸；(3)往步骤(2)的混合物中加入双蒸水、石墨烯量子点和硝酸银溶液进一步混合孵育；(4)银纳米粒子逐步沉积在石墨烯量子点表面，石墨烯量子点表面的荧光强度逐步降低，石墨烯量子点表面沉积的银纳米粒子的吸光度逐渐增加；(5)根据荧光强度或吸光度的变化，进行碱性磷酸酶活性的定量检测。所述步骤(1)中，石墨烯量子点的直径在10nm以下，平均直径为1～3nm，其荧光光谱的最大激发波长Ex和最大发射波长Em分别为362nm和461nm。石墨烯量子点可通过柠檬酸加热得到，反应温度为220℃，反应时间为20min，然后逐滴加入到0.25M的氢氧化钠溶液中，充分搅拌10min，再用0.22μm的微孔滤膜过滤，3.5kDa的透析袋透析24h，真空冷冻干燥制得粉末。所述步骤(2)中，共同孵育的条件是温度为25～40℃，时间为10～20min。所述步骤(2)中，碱性缓冲溶液中含有无水硫酸镁，pH为9.8，所述碱性缓冲溶液选自三羟甲基氨基甲烷-硝酸缓冲溶液、二乙醇胺-硝酸缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中的至少一种，所述硫酸镁的浓度为0.2～2mM。所述L-抗坏血酸-2-磷酸的溶液，用量为50μL，浓度为10～40mM；目标物碱性磷酸酶溶液用量为20μL，缓冲液用量为200μL。加入多余的双蒸水的目的是将反应体系的最终体积定在2mL，用作溶剂和定容。所述步骤(3)中，混合孵育的条件为：温度为20～40℃，时间为20～60min，pH大于6。双蒸水体积为1580μL，量子点溶液的浓度为6～10mg/mL，用量为50μL，硝酸银溶液的浓度为10～40mM，用量为100μL。所述L-抗坏血酸-2-磷酸、石墨烯量子点和硝酸银溶液的体积比为1～3:1～3:1～6。所述步骤(3)中，纳米银粒子沉积在量子点表面得到纳米复合结构，所述纳米复合结构的直径在100nm以下，平均直径在10～20nm，在415nm波长处有最大紫外吸收。所述步骤(5)中，碱性酶活性的定量检测过程具体如下：配置一系列不同浓度的碱性磷酸酶标准品溶液加入到反应体系中，监测反应体系吸光度或相对荧光强度的变化，根据吸光度的变化ΔA415nm或相对荧光强度(F0-F)/F0随碱性磷酸酶标准品溶液活性的变化绘制标准曲线，得到碱性磷酸酶活性的标准曲线方程，将待测样品加入到反应体系中，监测反应体系吸光度的变化ΔA415nm或相对荧光强度的变化(F0-F)/F0，根据碱性磷酸酶活性的标准曲线方程，推算出碱性磷酸酶的用量，从而实现待测样品中碱性磷酸酶活性的定量检测。碱性磷酸酶用于催化L-抗坏血酸-2-磷酸(AA-P)反应得到L-抗坏血酸(AA)，L-抗坏血酸(AA)与硝酸银(AgNO3)反应生成纳米银粒子，纳米银粒子沉积在量子点表面得到纳米复合结构。L-抗坏血酸-2-磷酸溶液是过量的，石墨烯量子点和硝酸银的量是已知的。所述步骤(5)中，利用紫外可见光谱的比色法检测，碱性磷酸酶活性在0.3～10U/L范围内具有线性关系，检测限为0.1U/L；利用荧光光谱的荧光法检测，碱性磷酸酶活性在0.05～2.5U/L范围内具有线性关系，检测限为0.02U/L。一种使用所述的检测碱性磷酸酶活性的方法制备的传感器。如所述的一种传感器在碱性磷酸酶抑制剂中的应用。本专利技术的测定原理是：利用酶促反应和GQDs@Ag纳米复合结构的光学特性。碱性磷酸酶催化L-抗坏血酸-2-磷酸(AA-P)去磷酸化，生成具有还原性的L-抗坏血酸(AA)，可与硝酸银(AgNO3)发生氧化还原反应，生成银纳米粒子沉积于石墨烯量子点表面，随着碱性磷酸酶浓度的增加，银纳米壳的生成增加，检测液的颜色在可见光下从无色变为黄色，在365nm紫外灯下，量子点的荧光从明亮的蓝色荧光到荧光逐渐淬灭。紫外可见分光光度计下，随着纳米银粒子的生成增加，溶液在415nm处的吸光度逐渐增加。在荧光分光光度计下，随着纳米银粒子在量子点表面的沉积增加，量子点的荧光淬灭程度增加，量子点在Ex＝362nm，Em＝461nm处的荧光强度减弱。因此，利用比色法和荧光法可以达到定量检测的目的。基于紫外吸收增强和荧光淬灭的程度作为输出信号，碱性磷酸酶活性可被定量检测，同时能够制成生物传感器并将其应用在碱性磷酸酶抑制剂的研究及其筛选中。本专利技术相比现有技术具有以下优点：(1)本专利技术基于碱性磷酸酶的酶促反应、石墨烯量子点的荧光“开-关”效应以及纳米银的紫外吸收特性建立了高灵敏度的双重模式的碱性磷酸酶的检测方法。不仅可以通过肉眼对目标物碱性磷酸酶进行可视化鉴别，也可用比色法和荧光法对碱性磷酸酶进行定量检测。双重模式的检测通过两种方法输出测定结果，减小了环境波动引起的误差，保证了测定结果的可靠性，更适合实际应用；(2)相比之前报道的测定碱性磷酸酶的双重传感器存在的检测限不够低或者反应时间过长的问题，该方法得到的碱性磷酸酶双重传感器可以在较短的时间内完成高灵敏度的检测；(3)采用石墨烯量子点(GQDs)作为探针，具有合成简单、造价低廉、绿色无毒、理化性质稳定和生物相容性良好等优势；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备石墨烯量子点；(2)将碱性磷酸酶溶液投入到过量的L‑抗坏血酸‑2‑磷酸溶液中，然后将混合物置于碱性缓冲溶液中共同孵育，生成L‑抗坏血酸；(3)往步骤(2)的混合物中加入双蒸水、石墨烯量子点和硝酸银溶液进一步混合孵育；(4)银纳米粒子逐步沉积在石墨烯量子点表面，石墨烯量子点表面的荧光强度逐步降低，石墨烯量子点表面沉积的银纳米粒子的吸光度逐渐增加；(5)根据荧光强度或吸光度的变化，进行碱性磷酸酶活性的定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备石墨烯量子点；(2)将碱性磷酸酶溶液投入到过量的L-抗坏血酸-2-磷酸溶液中，然后将混合物置于碱性缓冲溶液中共同孵育，生成L-抗坏血酸；(3)往步骤(2)的混合物中加入双蒸水、石墨烯量子点和硝酸银溶液进一步混合孵育；(4)银纳米粒子逐步沉积在石墨烯量子点表面，石墨烯量子点表面的荧光强度逐步降低，石墨烯量子点表面沉积的银纳米粒子的吸光度逐渐增加；(5)根据荧光强度或吸光度的变化，进行碱性磷酸酶活性的定量检测。2.根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，石墨烯量子点的直径在10nm以下，平均直径为1～3nm，其荧光光谱的最大激发波长Ex和最大发射波长Em分别为362nm和461nm。3.根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，共同孵育的条件是温度为25～40℃，时间为10～20min。4.根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，混合孵育的条件为：温度为20～40℃，时间为20～60min，pH大于6。5.根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述L-抗坏血酸-2-磷酸、石墨烯量子点和硝酸银溶液的体积比为1～3:1～3:1～6。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张群林，卢海峰，张苗苗，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34