一株溶解甲藻的盐单胞菌菌株及含有其的固定化菌剂制造技术

本发明专利技术从中国东海浙江沿海地区赤潮多发区分离获得一株对甲藻具有高效溶解作用的细菌菌株，其分类命名为盐单胞菌DH‑xbzhu（

【技术实现步骤摘要】
一株溶解甲藻的盐单胞菌菌株及含有其的固定化菌剂
本专利技术涉及一种溶藻菌，具体涉及一种对甲藻具有高效溶解作用的盐单胞菌以及含有该菌种的固定化菌剂，以及制备固定化菌剂的方法。
技术介绍
随着工业化和城市化进程的加快，环境恶化、资源短缺等问题日益明显，尤其是海洋资源污染问题越来越突出。近年来，赤潮爆发次数越来越频繁，规模越来越大，尤其是由有毒甲藻引起的赤潮频频发生，例如，东海原甲藻是发生在该海域的原甲藻赤潮的主要原因藻之一，在长江口附近、浙江近海以及福建沿岸海域经常性引发大规模赤潮。赤潮对经济的发展以及人类健康造成了巨大的危害，因此，寻找到环保、经济、有效的赤潮治理方法尤为重要。目前的赤潮治理方法主要有物理法、化学法和生物法，但是由于物理法和化学法除藻具有费用高、二次污染等弊端，所以采用生物法防治赤潮引起了众多学者的关注，其中研究最多的就是利用溶藻细菌来治理赤潮。众多研究表明，细菌特别是溶藻菌在赤潮的治理中起着重要作用，因此溶藻细菌必然成为微生物防治赤潮的潜在资源库。相较于物理法和化学法治理赤潮，溶藻细菌具有特异性强、环境友好、成本低等优势。目前已报道的溶藻细菌主要属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)、噬纤维菌属(Cytophaga)、腐螺旋菌属(Saprospira)、黄杆菌属(Flavobacterium)、弧菌属(Vibrio)、希万氏菌属(Shewanella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、Planomicrobium属和微球菌属(Micrococcus)等。同时，研究发现溶藻细菌溶解藻细胞主要有两种方式：一是直接溶藻，即菌株与藻细胞表面直接接触，或入侵藻细胞内，进而抑制藻细胞生长或导致藻细胞裂解；二是间接溶藻，即通过分泌胞外代谢物质实现溶藻，该方式是溶藻细菌的主要作用方式。利用海洋细菌的溶藻作用防治赤潮，可以避免物理法与化学法治理赤潮带来二次污染的缺陷，是保持海洋环境生态平衡的可靠方法之一。但是，利用游离细菌来治理赤潮，存在有效浓度低、反应启动慢、菌体易流失、与环境竞争力弱、抗有毒污染能力差、对废水水质水量适应性较差等缺点，为了解决这些缺点和不足，人们开始将传统的生物方法与微生物固定化技术相结合。微生物固定化技术是通过利用物理或化学手段将游离微生物定位于限定的空间区域，并使其保持活性和可以反复使用的一种技术，固定化微生物技术具有微生物密度高、反应迅速、微生物流失少、产物易分离以及反应过程易控制等优点。常用的微生物固定化方法有：吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等，其中包埋法具有制备方法简单，反应条件温和，微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，微生物活性高、细胞容量大、固定化效率高等优点，使用较为广泛。常用的包埋固定化材料有：琼脂、海藻酸钠、聚乙烯醇、明胶、聚丙烯酰胺等。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，仍需不断寻找和分离具有高效溶藻作用的细菌菌种，本专利技术对溶藻菌进行了大量的筛选和研究工作，最终从中国东海浙江沿海地区赤潮多发区分离获得一株新的具有高效溶藻作用的细菌菌种。因此，本专利技术的第一目的在于提供一种可高效抑制赤潮藻的细菌，为利用生物法治理赤潮提供新途径。本专利技术提供的溶藻菌已于2014年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，CCTCC)，该菌种保藏号为CCTCCNO:M2014541，保藏地址为中国武汉武汉大学，分类命名为盐单胞菌DH-xbzhu(Halomonasp.DH-xbzhu)。针对利用游离溶藻菌治理赤潮的不足，本专利技术的第二目的在于提供一种固定化菌剂，所述固定化菌剂含有上述对甲藻具有溶解作用的细菌菌株。作为对上述技术方案的进一步改进，所述固定化菌剂含有包埋剂海藻酸钠与聚乙烯醇。作为对上述技术方案的进一步改进，所述固定化菌剂含有交联剂氯化钙和硼酸。本专利技术的第三目的在于提供一种上述固定化菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：（1）细菌扩增及浓缩：将所述对甲藻具有溶解作用的细菌菌株扩大培养，浓缩，配置成浓缩液；（2）包埋剂配制：将重量浓度为2～5%的海藻酸钠，重量浓度为4～8%的聚乙烯醇分别置于水中，在80～100℃条件下水浴溶解，灭菌后混合均匀，制得混合包埋剂；（3）交联剂配制：将1g氯化钙溶液溶解于饱和硼酸溶液，灭菌后混合均匀，制得交联剂，4℃保存备用；（4）固定化菌剂制备：将步骤（1）所制得的浓缩液以1:20体积比与步骤（2）所制得的包埋剂混合均匀，逐滴加入步骤（3）所制得的交联剂，制成直径4mm的颗粒，在4℃下固定24h；（5）保存：将步骤（4）所制得的颗粒用无菌水清洗3～4次，置于无菌海水中，于4℃冰箱保存。作为对上述技术方案的进一步改进，海藻酸钠的重量浓度为5%，聚乙烯醇的重量浓度为4%。本专利技术的再一目的在于提供一种上述细菌菌株在溶解甲藻中的用途。优选地，其中所述甲藻为东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、塔马亚历山大藻(Alexandriumtamarense)或米氏凯伦藻(KareniamikimotoiHansen)。本专利技术的再一目的在于提供上述固定化菌剂在溶解甲藻中的用途。优选地，其中所述甲藻为东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、塔马亚历山大藻(Alexandriumtamarense)或米氏凯伦藻(KareniamikimotoiHansen)。本专利技术的优点为：1.本专利技术的盐单胞菌DH-xbzhu通过间接作用抑制甲藻，当细菌培养滤液的溶藻效果随着浓度的增加而随之增强，并且浓度比例在1.00%以上（含1.00%）时，溶藻率均达到90%以上。2.将本专利技术的盐单胞菌DH-xbzhu固定化后的所得到的固定化菌剂仍保持良好的活性，易于储存备用，其机械强度、传质性能、密度、膨胀性都在良好水平。3.本专利技术的固定化菌剂成球方便容易，操作简单，所用材料经济易得，易于大范围推广。4.本专利技术溶藻菌固定包埋后仍具有良好的溶藻效果，并能储存、重复使用，固定化菌剂克服了利用游离菌治理赤潮的缺点，在流动水体中不易流失，回收简单。5.本专利技术的菌株及含有该菌种的固定化菌剂对于我国海域的环境保护、水产养殖业发展以及人群健康保障等方面具有重要的科学意义与实用价值，将产生不可估量的经济效益、环境效益和社会效益。附图说明图1A、1B为本专利技术的Halomonasp.DH-xbzhu的扫描电镜照片。图2为本专利技术的Halomonasp.DH-xbzhu的16srRNA系统进化树。图3为本专利技术的Halomonasp.DH-xbzhu的代谢产物抑制东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)的抑制效果。图4为本专利技术的Halomonasp.DH-xbzhu的代谢产物抑制塔马亚历山大藻(Alexandriumtamarense)的抑制效果。图5为本专利技术的Halomonasp.DH-xbzhu的代谢产物抑制米氏凯伦藻(KareniamikimotoiHansen)的抑制效果。图6将Halomonasp.DH-xbzhu固定化制得的固定化菌剂的形态特征。图7为不同海藻酸钠、聚乙烯醇浓度对固定化菌剂颗粒直径的影响。图8为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株对甲藻具有溶解作用的细菌菌株，其分类命名为盐单胞菌DH‑xbzhu （Halomona sp.DH‑xbzhu），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2014541。

【技术特征摘要】
1.一株对甲藻具有溶解作用的细菌菌株，其分类命名为盐单胞菌DH-xbzhu（Halomonasp.DH-xbzhu），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO:M2014541。2.一种固定化菌剂，其特征在于：所述固定化菌剂含有如权利要求1所述的对甲藻具有溶解作用的细菌菌株。3.如权利要求2所述的固定化菌剂，其特征在于：所述固定化菌剂含有包埋剂海藻酸钠与聚乙烯醇。4.如权利要求3所述的固定化菌剂，其特征在于：所述固定化菌剂含有交联剂氯化钙和硼酸。5.一种如权利要求4所述的固定化菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）细菌扩增及浓缩：将所述对对甲藻具有溶解作用的细菌菌株扩大培养，浓缩，配置成浓缩液；（2）包埋剂配制：将重量浓度为2～5%的海藻酸钠，重量浓度为4～8%的聚乙烯醇分别置于水中，在80～100℃条件下水浴溶解，灭菌后混合均匀，制得混合包埋剂；（3）交联剂配制：将1g氯化钙溶液溶解于饱和硼酸溶液，灭菌后混合均匀，制得交联剂，4℃保存备用；（4）固定化菌剂制备：将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢丽玲，毕潇，韩光耀，朱炎坤，王爱霞，朱兴彪，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东,44