一种用于micro RNA检测的电化学发光活性DNA纳米探针的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于micro RNA检测的电化学发光活性DNA纳米探针的制备方法，该方法通过DNA探针与掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子自组装反应，制备了具有电化学发光活性的DNA纳米探针，所得DNA纳米探针在修饰电极表面具有富集效应，可用于电化学发光传感检测micro RNA。与现有技术相比，本发明专利技术无需复杂的DNA标记，具有灵敏、简单、普适性的特点，对micro RNA的检出限可达0.1pmol/L。

Preparation method of electrochemiluminescence active DNA nano probe for micro RNA detection

The invention discloses a preparation method for the electrochemical detection of RNA micro luminescence activity DNA nano probe, the silica nanoparticles and chitosan doped DNA probe and bipyridine ruthenium self-assembly reaction, DNA nano probe with electrochemical luminescence activity was prepared, the nano probe has enrichment effect in DNA the modified electrode surface, can be used for the electrochemical detection of micro RNA light sensor. Compared with the prior art, the invention does not need DNA labeled complex, sensitive, simple and universal characteristics of the detection limit of 0.1pmol/L micro RNA.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米检测
，具体涉及一种DNA探针通过与掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子自组装，制备用于检测microRNA的DNA纳米探针的方法。
技术介绍
DNA纳米探针，因其具有可化学合成、性质稳定、识别广泛且具有信号报告能力等优点，而越来越多的被应用于生物分析。现有的DNA纳米探针制备技术多数是将DNA探针通过化学键合作用固定于纳米材料表面或对其进行信号分子标记，有些还需要酶进行辅助，这会使实验步骤繁琐、实验成本高；另一方面，将DNA探针通过化合键合作用固定于纳米材料表面会大大降低探针的空间自由度，使其在识别目标分子的过程中由于空间位阻等的影响而使分子识别能力降低。因此，发展新的DNA纳米探针的制备方法、克服上述不足之处就具有重要的科学与应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于发展一种制备过程简单、无需DNA标记的DNA纳米探针的制备方法。解决上述技术问题所采用的技术方案由以下步骤组成：1、制备掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子将壳聚糖加入质量分数为0.1％的醋酸水溶液中，配制成质量体积浓度为0.5～5mg/mL的壳聚糖溶液，然后将所得壳聚糖溶液加入到TritonX-100与正己醇、环己烷、超纯水的混合液中，再加入0.01mol/L的联吡啶钌水溶液，用0.1mol/LNaOH水溶液调节体系至中性，室温搅拌30～60分钟，加入正硅酸乙酯和氨水，继续搅拌20～24小时，加入丙酮破乳，离心分离，所得固体依次用无水乙醇和超纯水洗涤，得到掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子。2、制备DNA纳米探针将步骤1得到的掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子分散于超纯水中，然后加入与待检测microRNA相对应的DNA探针，控制反应体系中掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子的浓度为0.10～0.25mg/mL、DNA探针的浓度为5×10-10～5×10-8mol/L，室温反应30～40分钟，离心分离，并用1.0mmol/LpH＝6.0的PB缓冲液洗涤1～2次，得到DNA纳米探针。上述步骤1中，优选正硅酸乙酯与壳聚糖溶液、联吡啶钌水溶液、氨水、超纯水的体积比为1:1.5～2.0:0.3～0.8:0.6～0.8:3～3.5，优选TritonX-100与正己醇、环己烷、超纯水的体积比为1:1:4.0～4.3:0.1～0.3。上述步骤2中，优选控制反应体系中掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子的浓度为0.15～0.20mg/mL、DNA探针的浓度为5×10-9～4.5×10-8mol/L，其中所述的DNA探针分散于1.0mmol/LpH＝6.0的PB缓冲液中。本专利技术通过DNA探针与掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子自组装，制备成用于检测microRNA的DNA纳米探针。与现有技术相比，本专利技术具有如下特点：1、本专利技术无需复杂的标记和固定DNA探针分子操作过程，其主要利用DNA探针分子在纳米材料表面的自组装来制备DNA纳米探针，只要DNA探针是单链DNA且碱基个数为20～35个，对DNA探针的碱基序列没有要求，因此具有普遍适用性。2、由于DNA探针在纳米粒子表面的特殊组装形态，使目标microRNA更易与组装在纳米粒子表面的DNA探针杂交，并释放出电化学发光纳米粒子，因而采用电化学发光分析技术可以快速、高效的识别目标microRNA，且目标microRNA的检出限低，可达0.1pmol/L。附图说明图1是实施例1制备的DNA纳米探针的透射电子显微镜图。图2是实施例1制备的DNA纳米探针(曲线a)和DNA纳米探针与let-7a作用后(曲线b)的电化学发光对比图。图3是实施例1制备的DNA纳米探针对let-7a的线性关系图。图4是实施例1制备的DNA纳米探针对let-7a的电化学发光叠加图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限这些实施例。实施例11、制备掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子将0.2g壳聚糖加入100mL质量分数为0.1％的醋酸水溶液中，配制成质量体积浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液，然后将150μL所得壳聚糖溶液加入到1.8mLTritonX-100与1.8mL正己醇、7.5mL环己烷、300μL超纯水的混合液中，搅拌30分钟，再加入50μL0.01mol/L联吡啶钌水溶液，并加入0.1mol/LNaOH水溶液调节体系至中性，室温搅拌60分钟，依次加入90μL正硅酸乙酯与60μL氨水，室温继续搅拌24小时，加入丙酮破乳，离心分离，所得固体依次用无水乙醇和超纯水洗涤，得到掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子。2、制备DNA纳米探针将步骤1得到的掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子分散于超纯水中，然后加入与let-7a相对应的DNA探针(碱基序列为AACTATACAACCTACTACCTCA，分散于1.0mmol/LpH＝6.0的PB缓冲液中，浓度为4×10-8mol/L)，控制反应体系中掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子的浓度为0.15mg/mL、DNA探针的浓度为2×10-8mol/L，室温反应30分钟，离心分离，并用1.0mmol/LpH＝6.0的PB缓冲液洗涤1～2次，得到DNA纳米探针，将其分散在1.0mmol/LpH＝6.0的PB缓冲液中冷藏保存。采用JEM-2100型透射电子显微镜(日立，日本)对所得DNA纳米探针分别进行表征，结果见图1。由图可见，制备成的DNA纳米探针表面可看到明显的由于疏水性碱基朝外而形成的水泡，说明DNA探针被成功自组装在复合纳米粒子表面。为了证明本专利技术的有益效果，专利技术人采用实施例1制备的DNA纳米探针检测let-7a，具体试验如下：1、电化学发光检测(1)DNA纳米探针与let-7a的杂交反应取20μL分散于1.0mmol/LpH＝6.0的PB缓冲液的DNA纳米探针，加入20μL退火后的let-7a(用1.0mmol/LpH＝6.0的PB缓冲液配制，浓度为1×10-8mmol/L)，充分混匀后，室温杂交40分钟。(2)Nafion/MWNT修饰电极的制备将玻碳电极依次用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉在抛光布上打磨光亮，然后依次用乙醇和蒸馏水分别超声清洗5分钟，取出用超纯水冲洗后自然晾干。将1.5mgMWNT超声分散于3.0mL体积分数为0.05％的Nafion乙醇溶液中，然后取10μL该分散液滴涂在处理好的玻碳电极表面，室温下静置使其自然晾干形成Nafion/MWNT修饰电极。(3)电化学发光信号检测将Nafion/MWNT修饰电极先浸入到实施例1得到的DNA纳米探针分散液中，室温静置60分钟，用超纯水充分冲洗并晾干后，按照常规方法进行电化学发光检测，得到DNA纳米探针组装到Nafion/MWNT修饰电极上所对应的电化学发光强度I0；检测完后将Nafion/MWNT修饰电极再浸入步骤(1)DNA纳米探针与let-7a的杂交反应液中，室温静置60分钟后，再采用RFL-1型化学发光分析仪进行电化学发光检测，得到对应的电化学发光强度Ii，i为1～n之间的正整数。结果见图2。由图可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于micro RNA检测的电化学发光活性DNA纳米探针的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：(1)制备掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子将壳聚糖加入质量分数为0.1％的醋酸水溶液中，配制成质量体积浓度为0.5～5mg/mL的壳聚糖溶液，然后将所得壳聚糖溶液加入到Triton X‑100与正己醇、环己烷、超纯水的混合液中，再加入0.01mol/L的联吡啶钌水溶液，用0.1mol/L NaOH水溶液调节体系至中性，室温搅拌30～60分钟，加入正硅酸乙酯和氨水，继续搅拌20～24小时，加入丙酮破乳，离心分离，所得固体依次用无水乙醇和超纯水洗涤，得到掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子；(2)制备DNA纳米探针将步骤(1)得到的掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子分散于超纯水中，然后加入与待检测micro RNA相对应的DNA探针，控制反应体系中掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子的浓度为0.10～0.25mg/mL、DNA探针的浓度为5×10‑10～5×10‑8mol/L，室温反应30～40分钟，离心分离，并用1.0mmol/LpH＝6.0的PB缓冲液洗涤1～2次，得到DNA纳米探针。...

【技术特征摘要】
1.一种用于microRNA检测的电化学发光活性DNA纳米探针的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：(1)制备掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子将壳聚糖加入质量分数为0.1％的醋酸水溶液中，配制成质量体积浓度为0.5～5mg/mL的壳聚糖溶液，然后将所得壳聚糖溶液加入到TritonX-100与正己醇、环己烷、超纯水的混合液中，再加入0.01mol/L的联吡啶钌水溶液，用0.1mol/LNaOH水溶液调节体系至中性，室温搅拌30～60分钟，加入正硅酸乙酯和氨水，继续搅拌20～24小时，加入丙酮破乳，离心分离，所得固体依次用无水乙醇和超纯水洗涤，得到掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子；(2)制备DNA纳米探针将步骤(1)得到的掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子分散于超纯水中，然后加入与待检测microRNA相对应的DNA探针，控制反应体系中掺杂壳聚糖和联吡啶钌的二氧化硅复合纳米粒子的浓度为0.10～0.25mg/mL、DNA探针的浓度为5×10-10～5×10-8mol/L，室温反应30～40分钟，离心分离，并用1.0mmol/LpH＝6...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑行望，姚秀南，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61