棉花抗旱相关基因GhDRP1鉴定及应用制造技术

本发明专利技术公开了棉花抗旱相关基因GhDRP1鉴定及应用。一个新的棉花PP2C蛋白磷酸酶家族的基因GhDRP1，该基因在棉花干旱胁迫时表达受到诱导。GhDRP1的基因序列包含3个内含子和4个外显子。GhDRP1的基因编码区长1254bp，编码一个含有417氨基酸的蛋白质。GhDRP1蛋白定位于细胞核中。棉花受到干旱胁迫后，该基因表达显著上升，表明该基因是干旱诱导基因。实验表明，过量表达GhDRP1减弱了棉花的抗旱性，而抑制GhDRP1表达能够提高棉花的抗旱性。综上所述，本发明专利技术提供了一个在改良棉花抗旱性中具有重要应用价值的功能基因。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一个棉花抗旱相关基因GhDRP1的克隆与功能鉴定。
技术介绍
：植物生长发育与自然环境有密切的关系。干旱、洪涝、炎热、霜冻、盐碱、病虫害、杂草等都会对植物生长发育造成不利的影响，往往严重影响农作物(如水稻、小麦、棉花等)的产量和品质，有数据显示50％的作物产量降低都是由非生物胁迫引起的。水对植物的生命活动起着巨大的作用，任何溶质都要溶解在水中才能被吸收利用，据估计，全球因不良环境因素导致的作物减产的一半以上是干旱缺水所致。棉花是世界上最主要的纤维作物，隶属锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)，原产于亚热带。依照其基因组构成可分为异源四倍体棉花(AADD)和二倍体棉花(AA或DD)。目前种植的主要是异源四倍体棉花(约占全部棉花种植面积的95％以上)，二倍体棉花种植较少。异源四倍体棉花又分为陆地棉(G.hirsutum)与海岛棉(G.barbadense)。陆地棉原产中美洲，其适应性广，是目前种植最多的棉花品种，约占全部棉花种植面积的90％以上。我国新疆及黄河长江流域，夏秋季常常晴热少雨，伏旱的发生比较频繁。棉花在此天气状况下，因蒸腾作用加大，水分供需失调，叶片出现萎蔫，棉株生长发育受阻，造成蕾铃加剧脱落现象，对棉花产量和品质影响很大。因此，培育耐旱棉花品种，对于我国棉花产业的长远发展极其重要。植物在长期进化过程中形成了一系列的信号转导机制来避免引起细胞内水分亏缺。已有研究表明，植物激素脱落酸(ABA)参与了包括种子萌发、休眠、营养器官发育以及胁迫耐受性等多种生理功能。其中，蛋白质的磷酸化和去磷酸化在ABA参与的信号转导途径中发挥重要功能。目前在植物中已鉴定了多种蛋白激酶和蛋白磷酸酶。有关蛋白激酶方面的研究较多，而蛋白磷酸酶方面的研究相对较少，已有的研究发现，与蛋白激酶一样，蛋白磷酸酶对生物体内的有关代谢也起着重要的调节作用。根据底物特异性，真核生物中蛋白磷酸酶可分为两大类：酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)和丝氨酸或苏氨酸蛋白磷酸酶。酪氨酸蛋白磷酸酶又分为酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)和双特异性蛋白磷酸酶(DSPTP)。根据氨基酸序列和晶体结构的不同，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的分类为PPP和PPM的基因家族。PPP家族蛋白磷酸酶又分为3类：PP1，PP2A和PP2B，而PPM家族蛋白磷酸酶包括PP2C和丙酮酸脱氢酶磷酸酶。研究表明植物中PP2C可能在许多信号转导途径中都作为负调控因子起作用，调节各种环境胁迫(如干旱，冷，伤害等)。虽然目前对PP2C的研究取得了较大的进展，但对于植物PP2C的功能及其作用底物仍知之甚少。PP2C是一类含丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白磷酸酶，酶催化活性依赖于Mg2+或Mn2+。PP2C蛋白磷酸酶没有调节亚基，是一种单体酶，酶的催化区域有11个保守的基序，这个基序与细胞内的信号转导有关，其中包括一些跨膜区域和一些参与蛋白激酶互作的区域。真核生物中PP2C的催化结构域在蛋白N端或C端。拟南芥76个PP2C中，有44个PP2C的催化区域是位于C端，其余的则位于N端。除了6个PP2C不能聚类以外，其他拟南芥PP2C可分为10类(A–J)。PP2C蛋白磷酸酶通过去磷酸化作用负调控蛋白激酶级联信号系统，参与细胞周期、胁迫信号转导、基因转录、蛋白质翻译及翻译后修饰等细胞活动过程。目前研究最多的是A类PP2C，发现它们在ABA信号通路中起重要作用，与SnRKs构成ABA信号通路的核心。当植物受干旱或高盐胁迫时，体内的ABA积累，ABA与受体PYL结合后，促进PYL与PP2C结合，形成ABA-PYL-PP2C三元复合体，这样就使得被PP2C去磷酸化而失活的SnRKs重新被磷酸化而激活，被激活的SnRKs磷酸化其下游的钾离子通道蛋白和ABF/bZIP蛋白，从而调节ABA诱导基因的表达，进而调节气孔的开闭，种子的萌发等。对拟南芥PP2C单突变体、双突变体以及多突变体的研究表明，当PP2C功能缺失后植物提高了抗旱能力。在植物体中PYL的量是有限的，而PP2C的表达会受ABA的诱导。因此，过量的PP2C会进一步抑制SnRKs的活性。ABA对种子萌发和休眠、叶片的气孔关闭和水分控制等都有显著的调控作用，也能调节植物对外界环境胁迫的响应。大量研究表明PP2C与ABA信号途径有关。拟南芥abil和abi2突变体对ABA非常敏感，这表明ABI1基因丧失功能后植物对ABA的敏感性增强，ABIl是ABA信号途径的负调控因子。Merlot等筛选出abi2的隐性回复突变体abi2-1R，其PP2C酶活性比野生型ABI2低100倍，但在种子萌发与调节气孔关闭上均与野生型无异。而双突变体(abi1-1R和abi1-1R)则又在种子萌发上比任何一个单突变体对ABA更敏感，于是认为ABI2也是ABA信号途径的负调控因子。ABI2与ABIl编码的蛋白质氨基酸序列有较高的同源性，二者包含PP2C核心区域的C-端区域有86％同源，不保守的N-端区域也有48％的同源性，但ABI1的N-端延伸区包含一个Ca2+结合位点的EF手型结构域，而ABI2的N-端延伸区不含EF-手型结构域，说明二者可能存在功能冗余。拟南芥PP2CA主要在叶中大量表达，在原生质体中瞬时表达能够阻断ABA信号途径。PP2CA的转录可受低温、干旱、高盐和ABA诱导，低温处理ABA缺陷型突变体aba1-1后PP2CA的转录降低，说明低温诱导的该基因表达是依赖ABA的，而干旱诱导的PP2CA基因表达是依赖ABA和ABI的。抑制PP2CA基因表达加速植物的冷适应性，从而提高其抗冻性。实验表明，PP2CA是ABA信号途径的负调控因子。此外，PP2CA能够与控制K+内向通道的蛋白AKT2相互作用，推测PP2CA可能通过与AKT2相互作用从而调控K+内向通道。作为植物体内较大的一类蛋白磷酸酶家族，PP2C具有特殊的结构特征和理化性质，并参与植物体内多种信号途径，而植物体内PP2C的多样性则表明其在不同的组织和器官中信号转导机制的多样性。因此，深入研究PP2C的生物学功能及作用机制，具有重要理论意义和应用价值。特别是棉花中关于PP2C蛋白磷酸酶家族的研究报导极少，因此，对于PP2C在棉花抗旱中的功能研究，将有助于揭示棉花抗旱应答的分子调控机制，克隆鉴定棉花抗旱相关的重要基因，直接应用于棉花品种改良。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个新的棉花抗逆相关的PP2C基因(GhDRP1)，分析揭示该基因的生物学功能，探索其在棉花抗逆过程中的作用机制，进而应用该基因改良棉花的抗旱性，创造棉花抗旱优良品种。为了研究棉花抗旱的分子机制，我们对两个不同品种(晋棉13号和鲁棉6号)的棉花幼苗进行了干旱处理，分别收取了正常浇水条件和干旱处理3天、5天和7天的棉花叶片材料，提取RNA，委托武汉生命之美公司进行转录组测序分析。分析结果表明，GhDRP1基因的表达是受干旱诱导的。在较短时间干旱处理时，该基因在鲁棉6号叶片中诱导表达水平高于晋棉13号，但在长时间干旱条件下，该基因诱导表达水平在晋棉13号叶片中要高于鲁棉6号(如图2所示)。序列分析发现，该基因编码一个含有PP2C结构域的蛋白质，序列如SEQ.ID.No.3所示，其与拟南芥A类PP2C蛋白的同源性较高，因此推本文档来自技高网...

【技术保护点】
棉花抗旱相关基因GhDRP1，其特征在于，序列如SEQ.ID.No.1所示，包含4个外显子和3个内含子，第一内含子从496‑602bp，共107bp，第二内含子从909‑1329bp，共421bp，第三内含子从1436‑1526bp，共91bp。

【技术特征摘要】
1.棉花抗旱相关基因GhDRP1，其特征在于，序列如SEQ.ID.No.1所示，包含4个外显子和3个内含子，第一内含子从496-602bp，共107bp，第二内含子从909-1329bp，共421bp，第三内含子从1436-1526bp，共91bp...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学宝，陈云，刘致浩，魏宁，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42