棒杆菌发酵生产L‑赖氨酸的方法及其启动子改造技术

本发明专利技术提供了发酵生产L‑赖氨酸的，其包括将棒杆菌属细菌染色体上一个或多个基因的启动子替换为EP5启动子；和，用上述改造而得到的细菌发酵生产L‑赖氨酸。另外，本发明专利技术还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的细菌和启动子等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于氨基酸发酵领域，具体而言，本专利技术涉及发酵生产L-赖氨酸的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的细菌及启动子等。
技术介绍
通过产L-赖氨酸的细菌（如，棒杆菌属的杆状细菌，尤其是谷氨酸棒杆菌）发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。通过基因工程改造棒杆菌属的细菌，主要是通过增加或减少与L-赖氨酸代谢途径相关的酶活性或表达量来实现的。例如，中国专利CN1017906B公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含合成二氢二吡啶羧酸合成酶和/或琥珀酰四氢吡啶羧酸合成酶的重组DNA的棒状杆菌属细菌来发酵的步骤；中国专利申请CN1187539A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含编码天冬氨酸激酶和编码二氨基庚二酸脱羧酶的重组DNA的棒杆菌属细菌来发酵的步骤；中国专利申请CN1310234A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含α－酮戊二酸脱氢酶的基因的棒杆菌属细菌来发酵的步骤；中国专利申请CN1890372A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用果糖-1，6-二磷酸酶活性增加谷氨酸棒杆菌来发酵的步骤；中国专利申请CN101065484A公开了具有产生L－氨基酸的能力的棒菌属细菌，其被修饰使得乙酰辅酶A水解酶活性减少；中国专利申请CN104245921A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含编码木糖异构酶和木酮糖激酶的基因的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。要增加酶活性，除了改造基因本身之外，主要涉及对启动子的改进。然而，现有技术中对棒杆菌属的杆状细菌的启动子改进很少，多数仍旧保留了野生型启动子，如CorynebacteriumglutamicumATCC13869株（可参见GenBank:CP016335.1的第2531528至2531972位）、CP株（可参见GenBank:CP012194.1的第2575805至2576249位）、ZL-6株（可参见GenBank:CP004062.1的第2560677至2561121位）、BrevibacteriumflavumZL-1（（可参见GenBank:|CP004046.1的第2569176至2569620位）的。而本专利技术人经过长期研究和实践，经历了众多的失败，凭借了一些运气，发现对cspB基因的野生型的启动子的两个位点进行突变，即可获得改进的启动子，用其替换棒杆菌属的杆状细菌染色体上的其他位置上的野生型启动子，也能增强相应基因的表达，并最终提高L-赖氨酸的产量。尤其是，该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于多种细菌发酵生产L-赖氨酸。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。另外，本专利技术还涉及相应改造获得的细菌，以及其中所使用的启动子及其表达盒、载体和宿主细胞等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括：（1）将棒杆菌属细菌染色体上一个或多个基因的启动子替换为EP5启动子，其中，所述基因编码酶活性和/或表达量提高有利于提高L-赖氨酸产量的蛋白质，所述EP5启动子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是与如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述启动子的启动活性，并且其第51位保持为C，其第88位保持为T；和，（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。替换的技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本专利技术的具体实施方式中，根据同源重组的原理，可以采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，也可以采用pK18mobsacB质粒系统来进行改造。因此，在本文中，替换优选是通过同源重组进行的替换。被替换的基因的启动子优选是该基因的野生型的启动子。在本文中，野生型的启动子可以被定义为谷氨酸棒杆菌ATCC13032（其基因组全序列可获取自网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的基因的启动子。在本文中，所述基因编码酶活性和/或表达量提高有利于提高L-赖氨酸产量的蛋白质。这些基因不限于本专利技术实施例和
技术介绍
部分所列的。被替换的基因的启动子可以是一个，也可以是多个，优选是几个，如2-6个。在本专利技术的具体实施方式中被替换的基因的启动子分别有1、2、3、4个。本专利技术人设计改造的启动子的关键在于对应于SEQIDNO：1的第51位保持为C，其第88位保持为T，因此这两个位点保持不变后，其他位置可以有少许变化，包括添加、缺失和/或替换一个和/或几个核苷酸。本专利技术的EP5启动子的多核苷酸序列优选是与如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有95%（更优选97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列。通过常规的Blast和FASTA等程序，本领域技术人员可以计算出多核苷酸序列的同一性。相应地，本专利技术还提供了其他的应用或方法。例如，在第二方面，本专利技术提供了提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括：（1）将棒杆菌属细菌染色体上一个或多个基因的启动子替换为EP5启动子，其中，所述基因编码酶活性和/或表达量提高有利于提高L-赖氨酸产量的蛋白质，所述EP5启动子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是与如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述启动子的启动活性，并且其第50位保持为C，其第88位保持为T；和，（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。又如，在第三方面，本专利技术提供了改造获得的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，其中，所述改造获得是将棒杆菌属细菌染色体上一个或多个基因的启动子替换为EP5启动子，其中，所述基因编码酶活性和/或表达量提高有利于提高L-赖氨酸产量的蛋白质，所述EP5启动子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是与如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（优选95%，更优选97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述启动子的启动活性，并且其第51位保持为C，其第88位保持为T。还如，在第四方面，本专利技术提供了所述改造获得是将棒杆菌属细菌染色体上一个或多个基因的启动子替换为EP5启动子，其中，所述基因编码酶活性和/或表达量提高有利于提高L-赖氨酸产量的蛋白质，所述EP5启动子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是与如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（优选95%，更优选97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述启动子的启动活性，并且其第51位保持为C，其第88位保持为T。在本文中，如无特别限定（如未以“改造获得”来限定），术语“细菌”或“棒杆菌属细菌”是未改造或改造前的细菌或棒杆菌属细菌，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
发酵生产L‑赖氨酸的方法或者提高L‑赖氨酸的发酵量的方法，其包括：（1）将棒杆菌属细菌染色体上一个或多个基因的启动子替换为EP5启动子，其中，所述基因编码酶活性和/或表达量提高有利于提高L‑赖氨酸产量的蛋白质，所述EP5启动子的多核苷酸序列（a）如SEQ ID NO：1所示，或者，（b）是与如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列具有90%（优选95%，更优选97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述启动子的启动活性，并且其第51位保持为C，其第88位保持为T；和，（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L‑赖氨酸。

【技术特征摘要】
1.发酵生产L-赖氨酸的方法或者提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括：（1）将棒杆菌属细菌染色体上一个或多个基因的启动子替换为EP5启动子，其中，所述基因编码酶活性和/或表达量提高有利于提高L-赖氨酸产量的蛋白质，所述EP5启动子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是与如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（优选95%，更优选97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述启动子的启动活性，并且其第51位保持为C，其第88位保持为T；和，（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。2.改造获得的细菌在发酵生产L-赖氨酸或者提高L-赖氨酸的发酵量中的应用，其中，所述改造获得是将棒杆菌属细菌染色体上一个或多个基因的启动子替换为EP5启动子，其中，所述基因编码酶活性和/或表达量提高有利于提高L-赖氨酸产量的蛋白质，所述EP5启动子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是与如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（优选95%，更优选97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述启动子的启动活性，并且其第51位保持为C，其第88位保持为T。3.改造棒杆菌属细菌的方法，其包括将棒杆菌属细菌染色体上一个或多个基因的启动子替换为EP5启动子，其中，所述基因编码酶活性和...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟刚，魏爱英，马风勇，贾慧萍，马吉银，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64