标准化生物元件的设计和构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种标准化生物元件的设计和构建方法及其应用。本发明专利技术公开标准化生物元件的构建方法，包括如下步骤：(1)构建目的基因载体组、启动子载体组和终止子载体组。本发明专利技术基于酵母系统设计和构建了一系列标准化生物元件，利用II型限制性内切酶，可将标准化生物元件组装成超大长度的外源DNA片段，该外源DNA片段是由多个基因组成的目的产物合成途径，将该片段通过酵母同源重组整合到酵母染色体特定位点上，进行稳定表达，可实现目的产物酵母内异源合成，并且可以通过优化各基因的启动子实现目的产物的最优表达，从而在目的产物合成的优化过程中具有独到的优势和重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种标准化生物元件的设计和构建方法及其应用；特别涉及一种酿酒酵母中标准化生物元件的设计和构建方法及其应用，属于基因工程、代谢工程及合成生物学领域。
技术介绍
随着分子生物学和基因工程技术的发展，外源代谢途径在大肠杆菌、酵母甚至是哺乳类细胞中进行表达都已经能够实现。虽然这些表达系统都已经被广泛的研究，但目前仍然存在很多不足。一方面，某一代谢产物的代谢途径需要多基因协同作用，各基因常常需要不同程度的表达调控。例如，产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)内的固氮途径由20个基因组成，并且存在着很多未知的调控因子，因此很难构建和优化整个的外源代谢途径。另一方面，虽然分子生物技术的发展使我们有能力在较短的时间内合成大片段染色体，甚至整个基因组，但其所需要的花费也是巨大的。Gibson assembly和Golden Gate assembly的实验技术可以满足我们将小片段DNA合成大片段的部分要求，但是类似于大肠杆菌中BioBrick的标准化的组装元件与合成策略不能直接应用于酵母等真核微生物。酵母作为一种安全的真核微生物，同时具有强大的同源重组系统，仅利用很小的同源序列，便可进行准确和高效的同源重组，从而可以更为快捷的进行多基因、大片段DNA的组装。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是设计和构建标准化生物元件，将各标准化生物元件组装成超大长度的外源DNA片段，该外源DNA片段为多个基因组成的目的代谢途径(具体可为某种目的产物合成途径)，将该外源DNA片段同源重组到酵母染色体，通过对酵母中的目的产物的测定，优化目的代谢途径中各基因的启动子，以实现酵母中目的产物的最优表达。为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种标准化生物元件的构建方法，包括如下步骤：(1)构建目的基因载体组、启动子载体组和终止子载体组；所述目的基因载体组由G种含有目的基因的载体组成，每种所述含有目的基因的载体均含有一种目的基因、两个限制性核酸内切酶A位点、两个限制性核酸内切酶B位点，所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间，和所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间；所述G为大于等于1的自然数，G的值为要体外组装的目的代谢途径的基因总数(如要体外组装的目的代谢途径是β-胡萝卜素外源合成途径，该β-胡萝卜素外源合成途径的基因是crtE基因、crtI基因和crtYB基因,该β-胡萝卜素外源合成途径的基因总数是3，即G为3)；所述目的基因为要体外组装的目的代谢途径的基因，每种所述含有目的基因的载体中所含有的目的基因均不同；所述启动子载体组由P种含有启动子的载体组成，每种所述含有启动子的载体均含有一种目的启动子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点，所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间，和所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间；所述P为大于等于1的自然数，具体为大于等于2的自然数，P的值本领域技术人员可根据需要选择，如可以大于等于要体外组装的目的代谢途径的基因总数，也可以小于等于要体外组装的目的代谢途径的基因总数，每种所述含有启动子的载体中所含有的目的启动子均不同；所述终止子载体组由T种含有终止子的载体组成，每种所述含有终止子的载体均含有一
种目的终止子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点，所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间，和所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间；所述T为大于等于1的自然数，T的值本领域技术人员可根据需要选择，如可以大于等于要体外组装的目的代谢途径的基因总数，也可以小于等于要体外组装的目的代谢途径的基因总数，每种所述含有终止子的载体中所含有的目的终止子均不同；所述限制性核酸内切酶A位点和所述限制性核酸内切酶B位点中的所述“位点”包含其识别位点和切割位点；(2)用所述限制性核酸内切酶B酶切所述启动子载体组的载体，得到含有目的启动子的片段；用所述限制性核酸内切酶B酶切所述目的基因载体组的载体，得到含有目的基因的片段；用所述限制性核酸内切酶B酶切所述终止子载体组的载体，得到含有目的终止子的片段；(3)将所述含有目的启动子的片段中的一种片段、所述含有目的基因的片段中的一种片段和所述含有目的终止子的片段中的一种片段按照上游至下游方向依次连接得到一种目的基因表达盒，该一种所述目的基因表达盒为一种标准化生物元件。按照该方法连接共可得到P×G×T种目的基因表达盒，即P×G×T种标准化生物元件；所述限制性核酸内切酶A和所述限制性核酸内切酶B为不同种II型限制性核酸内切酶，具体为不同种IIS型限制性核酸内切酶。上述方法中，所述限制性核酸内切酶A为限制性核酸内切酶BsaI；所述限制性核酸内切酶B为限制性核酸内切酶BsmBI或Esp3I；所述目的基因载体组的含有目的基因的载体的构建包括如下步骤：用一种所述目的基因替换HCkan-O的两个BsaI位点间的片段(两个BsaI位点间的较小片段)，HCkan-O的其余序列保持不变，得到一种所述含有目的基因的载体；所述HCkan-O为一种环状载体，其序列如由序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.15所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示；所述启动子载体组的含有启动子的载体的构建包括如下步骤：用一种所述目的启动子替换HCkan-P的两个BsaI位点间的片段(两个BsaI位点间的较小片段)，HCkan-P的其余序列保持不变，得到一种所述含有启动子的载体；所述HCkan-P为一种环状载体，其序列如由序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.12所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示；所述终止子载体组的含有终止子的载体的构建包括如下步骤：用一种所述终止子替换HCkan-T的两个BsaI位点间的片段(两个BsaI位点间的较小片段)，HCkan-T的其余序列保持不变，得到一种所述含有终止子的载体；所述HCkan-T为一种环状载体，其序列如由序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.18所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示。为了解决以上技术问题，本专利技术还提供POT重组载体的构建方法，包括如下步骤：1)按照上述任一所述的方法制备标准化生物元件和制备POT载体组；所述POT载体组由两种以上(2种-P×G×T种)POT载体组成，每种所述POT载体含有所述的限制性核酸内切酶A位点和所述的限制性核酸内切酶B位点；2)用一种所述标准化生物元件替换所述POT载体组的一种POT载体的所述两个限制性核
酸内切酶B位点间的片段(两个限制性核酸内切酶B位点间的较小片段)，POT载体的其余序列保持不变，得到一种POT重组载体；不同种所述标准化生物元件替换所述POT载体组的不同种POT载体；所述不同种POT载体用于接收不同种所述标准化生物元件；具体地，所述POT载体组包括如下1)-11)所示的质粒中的至少一种：1)POT1质粒，该质粒的序列如SEQ ID No.21所示；2)POT2质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.22所示，第20本文档来自技高网...

【技术保护点】
标准化生物元件的构建方法，包括如下步骤：(1)构建目的基因载体组、启动子载体组和终止子载体组；所述目的基因载体组由G种含有目的基因的载体组成，每种所述含有目的基因的载体均含有一种目的基因、两个限制性核酸内切酶A位点、两个限制性核酸内切酶B位点，所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间，和所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间；所述G为大于等于1的自然数，G的值为要体外组装的目的代谢途径的基因总数；所述目的基因为要体外组装的目的代谢途径的基因，每种所述含有目的基因的载体中所含有的目的基因均不同；所述启动子载体组由P种含有启动子的载体组成，每种所述含有启动子的载体均含有一种目的启动子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点，所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间，和所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间；所述P为大于等于2的自然数，每种所述含有启动子的载体中所含有的目的启动子均不同；所述终止子载体组由T种含有终止子的载体组成，每种所述含有终止子的载体均含有一种目的终止子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点，所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间，和所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间；所述T为大于等于1的自然数，每种所述含有终止子的载体中所含有的目的终止子均不同；(2)用所述限制性核酸内切酶B酶切所述启动子载体组的载体，得到含有目的启动子的片段；用所述限制性核酸内切酶B酶切所述目的基因载体组的载体，得到含有目的基因的片段；用所述限制性核酸内切酶B酶切所述终止子载体组的载体，得到含有目的终止子的片段；(3)将所述含有目的启动子的片段中的一种片段、所述含有目的基因的片段中的一种片段和所述含有目的终止子的片段中的一种片段连接得到一种目的基因表达盒，该一种所述目的基因表达盒为一种标准化生物元件。...

【技术特征摘要】
1.标准化生物元件的构建方法，包括如下步骤：(1)构建目的基因载体组、启动子载体组和终止子载体组；所述目的基因载体组由G种含有目的基因的载体组成，每种所述含有目的基因的载体均含有一种目的基因、两个限制性核酸内切酶A位点、两个限制性核酸内切酶B位点，所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间，和所述目的基因位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间；所述G为大于等于1的自然数，G的值为要体外组装的目的代谢途径的基因总数；所述目的基因为要体外组装的目的代谢途径的基因，每种所述含有目的基因的载体中所含有的目的基因均不同；所述启动子载体组由P种含有启动子的载体组成，每种所述含有启动子的载体均含有一种目的启动子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点，所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间，和所述目的启动子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间；所述P为大于等于2的自然数，每种所述含有启动子的载体中所含有的目的启动子均不同；所述终止子载体组由T种含有终止子的载体组成，每种所述含有终止子的载体均含有一种目的终止子、所述两个限制性核酸内切酶A位点、所述两个限制性核酸内切酶B位点，所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶A位点之间，和所述目的终止子位于所述两个限制性核酸内切酶B位点之间；所述T为大于等于1的自然数，每种所述含有终止子的载体中所含有的目的终止子均不同；(2)用所述限制性核酸内切酶B酶切所述启动子载体组的载体，得到含有目的启动子的片段；用所述限制性核酸内切酶B酶切所述目的基因载体组的载体，得到含有目的基因的片段；用所述限制性核酸内切酶B酶切所述终止子载体组的载体，得到含有目的终止子的片段；(3)将所述含有目的启动子的片段中的一种片段、所述含有目的基因的片段中的一种片段和所述含有目的终止子的片段中的一种片段连接得到一种目的基因表达盒，该一种所述目的基因表达盒为一种标准化生物元件。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述限制性核酸内切酶A为限制性核酸内切酶BsaI；所述限制性核酸内切酶B为限制性核酸内切酶BsmBI或Esp3I；所述目的基因载体组的含有目的基因的载体的构建包括如下步骤：用一种所述目的基因替换HCkan-O的两个BsaI位点间的片段，HCkan-O的其余序列保持不变，得到一种所述含有目的基因的载体；所述HCkan-O为一种环状载体，其序列如由序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID
\tNo.15所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示；所述启动子载体组的含有启动子的载体的构建包括如下步骤：用一种所述目的启动子替换HCkan-P的两个BsaI位点间的片段，HCkan-P的其余序列保持不变，得到一种所述含有启动子的载体；所述HCkan-P为一种环状载体，其序列如由序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.12所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示；所述终止子载体组的含有终止子的载体的构建包括如下步骤：用一种所述终止子替换HCkan-T的两个BsaI位点间的片段，HCkan-T的其余序列保持不变，得到一种所述含有终止子的载体；所述HCkan-T为一种环状载体，其序列如由序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.18所示的DNA分子首尾连接得到的环状载体的序列所示。3.POT重组载体的构建方法，包括如下步骤：1)按照权利要求1或2所述的方法制备标准化生物元件和制备POT载体组；所述POT载体组由两种以上POT载体组成，每种所述POT载体含有两个权利要求1或2中所述的限制性核酸内切酶A位点和两个权利要求1或2中所述的限制性核酸内切酶B位点；2)用一种所述标准化生物元件替换所述POT载体组的一种POT载体的所述两个限制性核酸内切酶B位点间的片段，POT载体的其余序列保持不变，得到一种POT重组载体；具体地，所述POT载体组包括如下1)-11)所示的质粒中的至少一种：1)POT1质粒，该质粒的序列如SEQ ID No.21所示；2)POT2质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.22所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.23所示，第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；3)POT3质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.24所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.25所示，第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；4)POT4质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.26所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.27所示，第1位
\t至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；5)POT5质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.28所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.29所示，第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；6)POT6质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.30所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.31所示，第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；7)POT7质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.32所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.33所示，第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；8)POT8质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.34所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.35所示，第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；9)POT9质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.36所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.37所示，第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；10)POT10质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.38所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.39所示，第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；11)POT11质粒，该质粒的大小为5987bp，该质粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.40所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.41所示，第1位至第2070位的序列与SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列与SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列与SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同。4.一种将标准化生物元件体外组装成目的代谢途径的方法，包括如下步骤：将序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的5’同源臂、序列两端分别带有粘性末端的各标准化生物元件、序列两端分别带有粘性末端的选择标记基因、序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的3’同源臂通过碱基互补配对连接组装成目的代谢途径；或，将所述序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的5’同源臂、所述序列两端分别带有粘性末端的选择标记基因、所述序列两端分别带有粘性末端的各标准化生物元件、所述序列两端分别带有粘性末端的同源重组位点的3’同源臂通过碱基互补配对连接组装成目的代谢途径...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴俊彪，林继伟，吴庆余，董俊凯，
申请(专利权)人：清华大学，无锡青兰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11