红细胞的产生与用途制造技术

本发明专利技术涉及通过将造血干细胞在诱导细胞存活和增殖的蛋白质存在下进行分化而从造血干细胞产生红细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年3月11日提交的美国临时申请No.61/776,732和2013年3月12日提交的美国专利技术申请No.13/797,648的权益和优先权，这两个申请案以引用方式整体并入本文。以ASCII文本文件提交序列表以下ASCII文本文件提交的内容以引用方式整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：106417-0181_Seq_List.txt；记录日期：2013年3月10日，大小：9KB)。
本专利技术涉及在体外从造血干细胞产生成熟红细胞的新方法，以及成熟红细胞在体内的治疗和诊断用途。
技术介绍
红细胞(RBC)的输注常规上用于许多临床和手术应用。平均来说，每天需要39,000单位的血液，并且自2004年以来的数据表明，一年里有2900万单位的血液被输注(美国血库协会(AmericanAssociationofBloodBanks)网站)。单单这个措施，在过去60年里就已挽救了许多人的生命。随着医学治疗的进步和人口老龄化，对这种输注的需求继续增加。除了已得益于可供利用的红细胞输注的传统临床环境(如创伤患者的手术和治疗)之外，还有许多其中红细胞的输注会改变医护标准的独特情况。例如，在加勒比黑人血统的患者中有许多红细胞稀有表型(Douayetal.，TransfusionMedicineReviews21，91-100，2007(Douay等人，《输血医学评论》，第21卷，第91-100页，2007年))。它们被认为是稀有表型，因为缺乏抗原，如H或ABO血型。这类患者可发展对ABO血型抗原的中和抗体响应，使得他们不适合红细胞输注。实际上，这类患者必须接受来自同卵来源的输注以避免中和抗体响应，这在需要反复进行红细胞输注的病例(例如，镰状细胞患者等)中造成极大的挑战。另外，患有多种基于抗体的自身免疫性疾病并经历自身免疫性溶血性贫血的患者也可从红细胞输注得益。但是，这在寻找其红细胞与患者的自身抗体相容的供者或有限的一组供者方面提出挑战。本质上，这些患者经历与稀有血表型患者相同的挑战。此外，患有血红蛋白病和地中海贫血的患者具有导致他们的红细胞寿命较短的同类系突变(congenicmutation)。虽然采用输血来改善这些患者的生命与健康的想法早而有之，但所需要的输血频率造成重大问题。来自健康供者的红细胞的平均寿命为28天。这些患者所需要的输血次数多而频繁，并且造成医原性感染的风险显著增加。如果能够在体外产生红细胞并且提供平均寿命为120天的同步化红细胞的输注，则将大大减少这些患者所需要的输血次数并且真正改善他们的生活质量。在红细胞用于创伤和手术的传统临床用途的情形中，从供者收集的红细胞的寿命问题也是重要的。红细胞浓缩物储藏长达一个月，可能会导致红细胞群体需要至少24小时才能恢复其输氧能力。另外，这些浓缩物中的许多坏死红细胞会在接受者体内引发炎性响应及由这种炎性响应导致的并发症。如果能够在体外产生红细胞的持续供应，则将使医护人员预期有新鲜红细胞可用并使他们能满足对新鲜红细胞的需求，并且还将使得不需要长期储藏红细胞浓缩物。红细胞输注的另一个问题是红细胞输注的提供变得日益困难。这个日益困难的原因包括：由于已被证实通过输血传播的传染原的数目日益增多，适合输注的捐赠血的供应稳步下降；血红蛋白和氧转运体(全氟化碳)在临床环境中未能表现出作为红细胞替代品的功效；以及最近与促红细胞生成素(EPO)的使用相关的并发症。如果容易获得可产生确定的输注用红细胞产物的红细胞祖细胞连续供应，则将改变临床实践并使输血变成更安全更广泛使用的措施。但是，这种方法必须能够提供安全、有效且通用的红细胞供应。虽然已作出了一些初步的尝试来在体外从原代造血干细胞(源自骨髓、脐带血或外周血)或胚胎干细胞获得红细胞，但迄今为止这些尝试都未取得成功，原因有很多，包括以下一个或多个原因：费用、方案的持续时间、步骤多、饲养细胞或血清的使用、劳动密集型、产率低或者不能完全分化为成熟的无核红细胞。在体外产生红细胞的尝试包括从原代造血干细胞(Neildez-Nguyenetal.，NatBiotech20，467-72，2002(Neildez-Nguyen等人，《自然生物技术》，第20卷，第467-72页，2002年))和胚胎干细胞(Luetal.，Blood.2008Dec1；112(12)：4475-84(Lu等人，《血液》，2008年12月1日；第112卷，第12期，第4475-84页)；Luetal.，RegenMed3，693-704，2008(Lu等人，《再生医学》，第3卷，第693-704页，2008年))出发的方法。这些方法总体上也没有得到确定且连续的红细胞祖细胞来源。对以上文献和研究的引述并不意在承认任何前述文献和研究是相关的现有技术。所有有关这些文献的内容的陈述是基于本申请人可获知的信息，并不构成对这些文献的内容的正确性的任何承认。
技术实现思路
因此，对于改进的用于体外产生完全成熟人红细胞的方法存在着需求。本专利技术提供通过在一种或多种能诱导细胞存活或增殖中的一者或多者的重组蛋白(如外源蛋白)、EPO及任选地IL-3存在下培养造血干细胞(HSC)来产生红细胞(RBC)群体的新方法。有利地，这些方法在约10天时间产生表现出成人红细胞表型的成熟无核红细胞，所述表型包括但不限于血型糖蛋白A(GPA)的表达、成人血红蛋白水平提高、CD71(转铁蛋白受体)水平降低和胎儿血红蛋白水平降低。此外，从可在体外无限地传代、可冷冻保藏和可恢复的条件性无限增殖化的人长期造血干细胞产生红细胞，会使得可以从确定的、得到充分表征的来源连续地产生完全分化的红细胞。另外，通过本专利技术的新方法产生的红细胞还可含有和/或表达一种或多种可用来治疗需要进行治疗的受试者的目的重组蛋白。因此，本专利技术的某些方面涉及通过如下方式从造血干细胞产生成熟红细胞群体的方法：在EPO和一种或多种能促进细胞存活和/或增殖的第一重组蛋白或其生物活性片段存在下，在能诱导造血干细胞分化为成熟红细胞的条件下，培养该造血干细胞，从而产生成熟红细胞的群体。在一些实施例中，该造血干细胞是条件性无限增殖化的造血干细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该造血干细胞是蛋白质转导的造血干细胞，并且该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段是外源蛋白。在一些可与任何前述实施例进行组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从造血干细胞产生成熟红细胞群体的方法，所述方法包括：在EPO和一种或多种促进细胞存活和/或增殖的第一重组蛋白或其生物活性片段存在下；在诱导造血干细胞分化为成熟红细胞的条件下，培养造血干细胞，从而产生成熟红细胞群体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.11 US 61/776,732;2013.03.12 US 13/797,6481.一种从造血干细胞产生成熟红细胞群体的方法，所述方法包括：
在EPO和一种或多种促进细胞存活和/或增殖的第一重组蛋白或其生物活性片段
存在下；
在诱导造血干细胞分化为成熟红细胞的条件下，培养造血干细胞，从而产生成
熟红细胞群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段
从外源提供，通过诱导内源表达而产生或以转基因方式表达。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一重组蛋白或其
生物活性片段是一种或多种选自MYC多肽、ICN-1多肽、其同源物及其生物活性
片段的多肽。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一重组蛋白或其
生物活性片段中的一者或多者包含蛋白转导结构域。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是一种或多种选自TAT、
VPR和EPTD的蛋白转导结构域。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一重组蛋白或其
生物活性片段是TAT-MYC。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一重组蛋白或其
生物活性片段作为弹丸约每24小时、约每48小时或约每72小时提供。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中培养所述造血干细胞包括在IL-3
存在下培养所述造血干细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中培养所述造血干细胞包括在饲养细
胞和血清不存在下培养所述造血干细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法还包括在一种或多种抑制凋亡
的第二重组蛋白或其生物活性片段存在下培养所述成熟红细胞群体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片
段包含一种或多种Bcl-2同源结构域。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种Bcl-2同源结构域是一种或多
种选自BH1、BH2、BH3和BH4的Bcl-2同源结构域。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白是
Bcl-2、Bcl-w、Bcl-X、Bcl-XL或Mcl-1中的一者或多者。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白或
其生物活性片段是Bcl-2。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白或
其生物活性片段中的一者或多者包含蛋白转导结构域。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是一种或多种选自TAT、
VPR和EPTD的蛋白转导结构域。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白或
其生物活性片段是TAT-Bcl-2。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞还包含一种或多
种目的重组蛋白或其生物活性片段。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述成熟红细胞群体在约7至14
天产生。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述成熟红细胞群体表现出一种
或多种选自以下的特性：成熟红细胞群体，其中约40％至约100％的所述细胞是无
核的；...

【专利技术属性】
技术研发人员：布赖恩·柯蒂斯·特纳，Y·里菲利，G·A·伯德，
申请(专利权)人：泰加生物工艺学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US