鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域原核表达的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域原核表达的方法，包括下列步骤：（1）特异性引物的设计与合成；（2）鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆测序；（3）鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆表达；（4）第三结构域重组质粒pET-28 a-EM的表达与纯化。本发明专利技术所制备表达的鸭坦布苏病毒E蛋白具备良好的抗原性，可为建立ELISA方法、免疫荧光、免疫组化以及单克隆抗体的制备等提供原材料。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白原核表达的方法及其应用，属于生物基因工程领域。
技术介绍
：鸭源坦布苏病毒病毒（DuckTembusuvirus,DTMUV）属黄病毒科黄病毒属成员，是引起国内以卵巢炎为特征的水禽新发传染性疾病的主要病原，该病流行广泛、传播迅速、自2010年首次报道以来，病毒已在产蛋鸭、肉鸭和鹅等养殖水禽上发生感染，并造成产蛋严重下降等经济损失。DTMUV病毒编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中囊膜糖蛋白（envelopeprotein,简称E蛋白）是坦布苏病毒的主要结构蛋白，位于成熟病毒粒子表面，构成病毒颗粒的突起，在靶细胞受体结合，膜融合和病毒侵入过程中起着关键作用。具备较好的免疫原性和反应原性，是宿主抗感染免疫的主要保护性抗原，也是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。
技术实现思路
：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白原核表达的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域原核表达的方法，包括下列步骤：（1）特异性引物引物设计与合成：DTMUV-BamHⅠ-F(上游引物)P1：5’—GGATCCCTAGTGAAGAATCCTACCG—3’黑体部分为添加的BamHⅠ酶切位点；DTMUV-EcoRⅠ-R(下游引物)P2：5’—AAGTGAATTCACCCCCAACTGAGCC—3’黑体部分为添加的EcoRⅠ酶切位点；（2）鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆测序（3）鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆表达（4）重组质粒pET-28a-EM的表达与纯化所述的鸭坦布苏病毒E蛋白的第三结构域的克隆测序是：病毒RNA的提取按照病毒总RNA提取试剂盒的说明进行操作，RT-PCR反应体系按照PrimeScript?OneStepRT-PCRKit说明进行操作，反应程序：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min。反应结束后0.8%琼脂糖凝胶电泳检测电泳条带，胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。将回收的PCR产物送往大连宝生物工程有限公司进行测序鉴定。所述的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆表达是：以DTMUV-QD株病毒RNA为模板，E基因第三结构域的特异性引物进行RT-PCR扩增，连接转化按照《分子克隆实验指南》进行操作，构建重组表达质粒pET-28a-EM，并通过BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定及序列分析。所述的第三结构域重组质粒pET-28a-EM的表达与纯化是：重组质粒pET-28a-EM转化至大肠杆菌BL21(Rosetta)感受态细胞，37℃过夜培养，挑选单个菌落至2×YT培养基中，37℃震荡培养过夜，按1：100进行转种2×YT培养基中，37℃振摇培养，用终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达。将表达菌离心后加入PBS重悬菌体，超声波冰浴裂解，离心处理后的进行SDS-PAGE鉴定，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化重组E蛋白。本专利技术的方法中表达的鸭坦布苏病毒E蛋白可用于检测鸭坦布苏病毒和制备鸭坦布苏病毒抗体。本专利技术的有益效果：坦布苏病毒是在我国首次发现的对水禽致病的新型黄病毒，传播迅速、对鸭鹅危害大，已给中国水禽业造成巨大的经济损失，由于坦布苏病毒在中国爆发时间短，所以在该病毒的致病机理、跨物种传播机制及疫苗研制方面还存在很多迫切需要解决的难题。E蛋白是黄病毒的囊膜蛋白，也是主要的结构蛋白，同时研究结果表明，E蛋白是体外中和作用的主要靶点和病毒特异性抗体的作用位点，具有中和活性，能够刺激机体产生抗体引发特异性免疫。对E蛋白进行X射线晶体研究表明：第3结构域具备类免疫球蛋白样结构域，包含病毒结合受体。具备组成主要线性表位的区域，也包含病毒中和单抗的识别位点。本专利技术所构建的pET-28a-EM重组质粒经IPTG诱导可表达出分子量约20KD的E基因第三结构域重组蛋白，Westernblotting分析该融合蛋白与DTMUV阳性血清反应呈阳性。具备良好的抗原性，可为建立ELISA方法、免疫荧光、免疫组化以及单克隆抗体的制备等提供原材料。附图说明：图1是DTMUVE蛋白氨基酸序列的CDD分析结果。图2是DTMUVE蛋白的抗原性指数分析。图3是pet28a-EM重组质粒双酶切鉴定。M1:λ-HindⅢDNAMarker；M2:DL2000；1：pET28a-EM/BamHⅠ+EcoRⅠ；2：DTMUV-Erecombinantplasmid。图4是表达蛋白的SDS-PAGE鉴定。M:ProteinMWmarker(Broad)；1:未加IPTG诱导的沉淀；2:未加IPTG诱导的上；3:未加IPTG诱导的全蛋白；4:IPTG诱导的沉淀；5:IPTG诱导的上清；6:IPTG诱导的全蛋白。图5是重组6蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析。M．蛋白质分子量；1.IPTG诱导的菌液；2.Ni-NTA亲和层析柱洗脱峰（含有纯化的重组EM蛋白）。图6是表达蛋白的SDS-PAGE鉴定。M：Protionmarker；1：pET-28-EinducedbyIPTG；2：pET-28-EuninducedbyIPTG；3：ThewesternblottingoftheproteinsinducedbyIPTG；4：ThewesternblottingoftheproteinsuninducedbyIPTG。具体实施方式：实施例1鸭坦布苏病毒E基因第三结构域的原核表达1材料和方法1.1毒株、菌株与质粒DTMUVQD株由本实验室分离并保存。E.coliDH5α菌株、Rosetta(DE3)菌株及原核表达载体pET28a（+）由本室制备并保存；BKH细胞、骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存；1.2试剂M-MLV反转录酶、RazoalRNA提取试剂盒购自Promega公司；ExTaqDNA扩增用酶,IPTG、DNAmarker和限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ均购自大连宝生物工程有限公司；DNA片段凝胶快速回收试剂盒以及质粒提取试剂盒购自Tiangen公司；6×His蛋白质纯化树脂Ni-NTA购自QIAGEN公司；羊抗鸭HRP-IgG、羊抗鼠HRP-IgG购自Jackson公司；羊抗鼠FITC-IgG、PEG4000、HAT等购自Sigma公司；BALB/c购自山东大学实验动物中心。自然感染的康复鸭源DTMUV多抗由本实验室分离保存。主要生物信息学分析工具应用NCBIConservedDomains查找工具分析氨基酸序列保守结构域，应用DNAStarProtean软件模块进行抗原指数预测，用Emini原则预测特定区域位于蛋白质表面的可能性，应用亲水性、表面特性、柔韧性和二级结构4种参数联合的Jameson-Wolf法综合预测蛋白的抗原指数，并根据各结构域的抗原指数结果选取主要抗原域(Mai本文档来自技高网...

【技术保护点】
鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域原核表达的方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）特异性引物引物设计与合成：DTMUV‑BamHⅠ‑F(上游引物)P1：5’—GGATCCCTAGTGAAGAATCCTACCG—3’黑体部分为添加的BamHⅠ酶切位点；DTMUV‑ EcoRⅠ ‑R(下游引物)P2：5’— AAGTGAATTCACCCCCAACTGAGCC—3’黑体部分为添加的EcoRⅠ酶切位点；（2）鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆测序；（3）鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆表达；（4）第三结构域重组质粒pET‑28 a‑EM的表达与纯化。

【技术特征摘要】
1.鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域原核表达的方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）特异性引物引物设计与合成：
DTMUV-BamHⅠ-F(上游引物)P1：
5’—GGATCCCTAGTGAAGAATCCTACCG—3’黑体部分为添加的BamHⅠ酶切位点；
DTMUV-EcoRⅠ-R(下游引物)P2：
5’—AAGTGAATTCACCCCCAACTGAGCC—3’黑体部分为添加的EcoRⅠ酶切位点；
（2）鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆测序；
（3）鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆表达；
（4）第三结构域重组质粒pET-28a-EM的表达与纯化。
2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒E蛋白原核表达的方法，其特征在于，
所述的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆测序是：
病毒RNA的提取按照病毒总RNA提取试剂盒的说明进行操作，RT-PCR反应体系按照PrimeScript?OneStepRT-PCRKit说明进行操作，反应程序：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min；
反应结束后0.8%琼脂糖凝胶电泳检测电泳条带，胶回收试剂盒回收纯化PCR产物；
将回收的PCR产...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙涛，邓明俊，王超，房保海，徐彪，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37