一种间充质干细胞的预处理方法及其所得制剂技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞的预处理方法及其所得制剂，包括在低氧环境下将间充质干细胞在培养基中培养，其中所用的低氧环境氧气浓度自21％随培养时间逐渐降低。本发明专利技术所公开的预处理方法所培养的干细胞制剂能有效适应人体脂肪组织的低氧状态，提高对糖尿病的预防和治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种在低氧环境下对间充质干细胞培养进行预处理的方法，属于生物科技领域。
技术介绍
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是来源于发育早期的中胚层和外胚层的干细胞，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，由于间充质干细胞具有支持造血和调节免疫等作用，在造血重建、组织修复、免疫治疗等方面具有传统化学药物所无法实现的效果，因此在医学研宄和临床研宄中受到了广泛关注。目前，对间充质干细胞的培养方式是从来源组织中被分离出来之后，将其在大气环境中进行普通培养，经过4?6代的传代，使其扩增到一定数量，即可用于疾病干预。研宄发现，人类健康体内氧气浓度一般处于1%?12%，当通常大气环境中培养的间充质干细胞进行移植治疗时，移植的间充质干细胞面临氧气浓度从21%到低氧的变化，在不同的氧浓度环境下间充质干细胞的生物学特性是不同的，这种快速的氧浓度变化导致大量间充质干细胞的死亡，使得间充质干细胞在人体内的低氧环境条件下无法发挥干预疾病治疗的效果。针对上述问题，本领域近年来也提出过若干解决方案。申重阳等人曾提出了一种在移植前对干细胞进行程序性氧浓度预处理的方法，该方法为了提高间充质干细胞在低氧环境下的存活率对其培养环境进行了程序性处理，具体做法是将氧气浓度进行下述程序性调节:Oh:21% -15% ；2h:15% -10% ；4h:10% -5% ；6h:5% -2% ;8h_20h:2%培养至移植，该技术方案有效提高了间充质干细胞在低氧环境的存活率。但长期研宄也发现，该技术方案存在若干缺陷，突出表现在对氧气浓度的调整过于激进，使得间充质干细胞在培养过程中的存活率过低；更重要的是，该预处理方法调整了间充质干细胞的生物学特性，使其在正常疾病下的人体环境中无法发挥出正常间充质干细胞的疾病干预治疗特性。上述缺陷的存在，导致该方案多年来始终处于科研阶段，无法满足临床干预治疗需要。
技术实现思路
在多年和科研和临床研宄中，申请人对间充质干细胞的生物学特性进行了深入研宄，并创造性的专利技术了一种对间充质干细胞进行预处理的方法，大大提高了培养所得间充质干细胞在人体内低氧环境下的存活能力，更关键的该方法过程收率高，且所得间充质干细胞依旧保持了良好的干预治疗特性，具有优越的科研和临床应用前景。具体地说，本专利技术是通过如下技术方案实现的:一种间充质干细胞的预处理方法，在低氧环境下将间充质干细胞在培养基中培养，其中所用的低氧环境氧气浓度自21 %随培养时间逐渐降低。申请人广泛研宄了低氧环境的终浓度和氧气浓度降低速率对培养过程中的间充质干细胞收率及其活性的影响，发现将氧气浓度逐渐降低至氧气终浓度为9%具有理想的效果，因此本专利技术优选所述低氧环境的氧气终浓度为9%。更优选的，在所述低氧环境中，氧气浓度每隔4小时降低I %，至氧气终浓度为在本专利技术中，所用的培养基可选择干细胞培养领域常见基础培养基，包括但不限于M199，DMEM，IMDM, RPM1-1640, DF-12等。优选的，为了改善增值速度，还可以向其中加入合适的添加物，所述添加物包括但不限于胎(小)牛血清，生长因子，氨基酸，促粘附因子等，上述添加物的用量可根据实际需要进行调整，通常的，是在500ml基础培养基中加入5-50ml的添加物。为了提高间充质干细胞对低氧环境的适应性，启动其细胞周期调控，在其转移进入低氧培养箱时将氧浓度降低1%，然后每隔4小时将低氧培养箱的氧浓度降低1%，也就是共计降低12次，从21%降至9%。虽然间充质干细胞直接在低氧环境下培养能提高其存活能力，但是这样的培养方式导致间充质干细胞扩增速度慢、生产成本高。为了提高干细胞的生长和扩增速率，本专利技术的的预处理方法还包括在低氧环境培养前对间充质干细胞进行预培养的步骤，通过将间充质干细胞进行普通培养传代，传代至第3至第4代，有效扩增间充质干细胞的数量。为了提高间充质干细胞的质量，上述方法还包括对预培养的间充质干细胞进行筛选的步骤，搜集传代至间充质干细胞第3至第4代的贴壁生长的间充质干细胞将转移进入低氧培养环境中。相应的，本专利技术还公开了一种间充质干细胞制剂，基于本专利技术所公开的预处理方法培养得到。由于本专利技术所公开的间充质干细胞制剂的生物学特性，本专利技术还公开了所述间充质干细胞制剂在干预高血糖疾病治疗中的应用。众所周知，2型糖尿病患者的发病与身体的免疫异常状态有关，由于免疫系统攻击自身组织细胞的胰岛素受体，使其逐渐丧失对胰岛素的敏感性，从而发生高糖血症，进而进展至糖尿病。在易患2型糖尿病的肥胖人群身体中，脂肪组织占比较大，是主要消耗胰岛素的组织，也是免疫异常最容易涉及的组织。在采用间充质干细胞干预上述疾病治疗时，使间充质干细胞在进入体内之后尽快适应脂肪组织的低氧状态使是其发挥干预作用的基础，本专利技术公开的技术方案解决了该问题。【附图说明】图1为不同培养方法下间充质干细胞培养产物的显微镜观察图。【具体实施方式】为了说明本专利技术的实现方案及其效果，在如下实施例中申请人提供了本专利技术的若干较优实现，并通过实验的方式说明本专利技术的技术方案对提高间充质干细胞存活能力、活性的效果。本领域技术人员可以理解如下所提供的示例仅为示意性的，并不对本专利技术构成特别限定。实施例1:本专利技术公开的预处理方法，优选是通过如下过程进行的:用基础培养基和添加物培养间充质干细胞。在本实施例中，选择基础培养基为500ml的DMEM，添加物包括25ml的胎(小)牛血清、5ml生长因子、3ml氨基酸。这并非限制性的，本领域技术人员可根据需要选择其他合适的类型和成分。传代至第3至第4代时，搜集贴壁生长的间充质干细胞，转移到新的培养瓶中，将其转置于低氧培养箱中，培养48小时:间充质干细胞转移进入低氧培养箱时将氧浓度降低1%，之后每隔4小时将低氧培养箱的氧浓度降低1%，至氧气终浓度降至9% (在上述过程中二氧化碳浓度保持为5% )。对比实施例1间充质干细胞进行普通培养传代(采用与本专利技术方案同样的培养基)，传代至第3至第4代时，搜集贴壁生长的间充质干细胞，转移到新培养瓶中，在正常空气环境中培养48小时。对比实施例2间充质干细胞进行普通培养传代(采用与本专利技术方案同样的培养基)，传代至第3至第4代时，搜集贴壁生长的间充质干细胞，转移到新浮培养瓶中，在如下低氧环境中培养48小时:放入到培养箱中，调节细胞培养箱至02浓度为15% ;2h后调节细胞培养箱至02浓度为10% ；4h后调节细胞培养箱至02浓度为5% ；6h后调节细胞培养箱至02浓度为2% ；一直将细胞培养箱维持在02浓度为2%，至培养结束。申请人首先采用Invitrogen公司的全自动细胞计数仪Countess对培养所得间充质干细胞进行了细胞计数。上述三个实施例均采用原始活率为98.5%的间充质干细胞，对终产物进行检测结果显示，实施例1的间充质干细胞活率为98.3%、对比实施例1的间充质干细胞活率为65.8%，对比实施例2的间充质干细胞活率为88.3%，该试验结果显示尽管对比实施例2采用的程序性低氧培养过程也实现了间充质干细胞对低氧环境的适应，但是该方式氧气变化没有考虑到间充质干细胞对低氧环境的适应能力，使得干细胞活率降低较大。为了研宄上述不同的培养方式对间充本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种间充质干细胞的预处理方法，其特征在于在低氧环境下将间充质干细胞在培养基中培养，其中所用的低氧环境氧气浓度自21％随培养时间逐渐降低。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚伟，
申请(专利权)人：龚伟，
类型：发明
国别省市：天津;12