本发明专利技术公开了一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述shRNA包括分别与GH mRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的GH-mus-544、616位点的GH-mus-616和627位点的GH-mus-627；所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列。本发明专利技术能有效抑制小鼠GH基因表达，且4个GH shRNA过表达载体均具有很高的表达效率。
【技术实现步骤摘要】
一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用。
技术介绍
SmallinterferingRNAsiRNA是一种小RNA分子，它的核苷酸序列长度为～21-25，由Dicer，RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干涉RNAinterference，RNAi是指内源性或外源性双链RNA，dsRNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。小鼠生长激素mousegrowthhormone,mGH是小鼠垂体前叶分泌的一个单链多肽类激素，它能加速蛋白质的合成和脂类的代谢，因而具有较高的商业价值和科研价值，我们发现不同内含子对生长激素基因的表达有很大的差异。shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环loop序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在细胞或活体组织中输送“短干涉RNA”siRNA的一种办法是将siRNA序列作为“短发夹”克隆进真核表达载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”shRNA，并被RNAi通道处理。目前，缺乏一种有效抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种有效抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用。为了实现上述目的，本专利技术通过如下技术方案实现：本专利技术提供了一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，所述shRNA包括分别与GHmRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的GH-mus-544、616位点的GH-mus-616和627位点的GH-mus-627；所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列。进一步地，所述GH-mus-340的正义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述GH-mus-340的反义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；所述GH-mus-544的正义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，所述GH-mus-544的反义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；所述GH-mus-616的正义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，所述GH-mus-616的反义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；所述GH-mus-627的正义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:7所示的核苷酸序列，所述GH-mus-627的反义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:8所示的核苷酸序列。进一步地，所述正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；当siRNA的第一个碱基不是G时，在CACC后补加一个G。更进一步地，所述loop环的核苷酸序列是TTCAAGAGA；终止信号的核苷酸序列是TTTTTT。本专利技术所述的抑制小鼠GH基因表达的小干扰RNA质粒，所述所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板，经单链退火形成双链的shRNA分子后，分别插入到pGPU6/GFP/Neo载体中，构建4个干扰RNA质粒，分别为pGPU6/GFP/Neo-GH340、pGPU6/GFP/Neo-GH544、pGPU6/GFP/Neo-GH616及pGPU6/GFP/Neo-GH627。本专利技术所述的shRNA在抑制小鼠GH基因表达的药物中的应用。本专利技术所述的抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体在制备降低小鼠GH基因表达的试剂中的应用。有益效果：本专利技术能有效抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用。本专利技术设计的4条GHshRNA序列均有很好的抑制GH基因表达的活性，且4个GHshRNA过表达载体均具有很高的表达效率。涉及4个过表达小鼠GHshRNA载体的构建及4条专用GHshRNA片段。本专利技术通过荧光PCR及westernblot分别从mRNA及蛋白水平分析各对shRNA的干扰效率。附图说明图1为重组载体酶切鉴定图图2为本专利技术实施例重组载体的示意图；图3为QRT-PCR检测shRNA干扰后的GH表达图；图4为GH蛋白表达检测图；图5为GH蛋白表达灰度分析图。具体实施方式本专利技术结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。如图1至图5所示，本专利技术提供了一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，所述shRNA包括分别与GHmRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的GH-mus-544、616位点的GH-mus-616和627位点的GH-mus-627；所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列。所述GH-mus-340的正义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述GH-mus-340的反义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；所述GH-mus-544的正义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，所述GH-mus-544的反义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；所述GH-mus-616的正义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，所述GH-mus-616的反义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；所述GH-mus-627的正义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:7所示的核苷酸序列，所述GH-mus-627的反义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:8所示的核苷酸序列。所述正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；当siRNA的第一个碱基不是G时，在CACC后补加一个G。所述loop环的核苷酸序列是TTCAAGAGA；终止信号的核苷酸序列是TTTTTT。本专利技术所述的抑制小鼠GH基因表达的小干扰RNA质粒，所述所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板，经单链退火形成双链的shRNA分子后，分别插入到pGPU6/GFP/Neo载体中，所述载体包括pGPU6、GFP和Neo。构建4个干扰RNA质粒，分别为pGPU6/GFP/Neo-GH340、pGPU6/GFP/Neo-GH544、pGPU6/GFP/Neo-GH616及pGPU6/GFP/Neo-GH627。本专利技术所述的shRN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述shRNA包括分别与GHmRNA序列特异性结合在340位点的GH‑mus‑340、544位点的GH‑mus‑544、616位点的GH‑mus‑616和627位点的GH‑mus‑627；所述GH‑mus‑340、GH‑mus‑544、GH‑mus‑616、GH‑mus‑627的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA载体，其特征在于：所述shRNA载体包括与GHmRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340；所述GH-mus-340的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列；其中，所述GH-mus-340的正义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述GH-mus-340的反义链模板的核苷酸序列是SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的抑制小鼠GH基因表达的shRNA载体，其特征在于：所述正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘...
【专利技术属性】
技术研发人员：鞠辉明，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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