棉花纤维特异表达启动子TB17P1及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉一种棉花纤维特异表达启动子TB17P1及其应用。本发明专利技术要解决的技术问题是为改良棉花的纤维品质提供一种新选择。本发明专利技术提出的棉花纤维特异性表达的启动子TB17P1具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了还有所述启动子的表达载体。本发明专利技术还提供了含有所述表达载体的宿主。本发明专利技术成功地分离了棉花纤维特异表达的GhTUB17基因的TB17P1启动子，并证实了所述TB17P1启动子序列在棉花中具有纤维表达特异性，为基因工程改良棉花纤维的产量和品质提供了可能性和有效途径。

【技术实现步骤摘要】
棉花纤维特异表达启动子TB17P1及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉一种棉花纤维特异表达启动子TB17P1及其应用。
技术介绍
我国是棉花生产和消费大国，棉花生产在我国国民经济中占有重要的地位。利用传统的育种方法曾在棉花品种改良上取得了较大的成功，但近20年来，世界棉花品种的产量已经达到平台期。因此，利用现有的遗传资源和传统育种手段难以再大幅度提高棉花产量。基因工程方法具有后代易于稳定，育种周期短等优点，可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移。利用基因工程改良棉花产量和纤维品质是解决这一难题的有效途径。但基因工程在作物改良中的作用发挥取决于三个方面的进展程度：目标基因的功能、调控目标性状的分子机理和控制目标基因在特定部位表达的特异启动子。在棉花纤维品质和产量的基因工程改良中，常常需要在纤维细胞中超量或抑制一些基因的表达，来达到提高产量或改良品质的目的。同时棉花纤维产量的重要指标是棉花育性，而花粉育性是棉花育性的重要指标，直接关系到棉花成铃率、座果率和产量，因此需要有纤维花粉特异的启动子来控制目标基因的表达。在棉花纤维发育的分子机理研究中，也需要纤维细胞特异表达启动子来上调或下调目标基因的表达，进而分析其在纤维细胞中的功能。最大限度地减少目标基因对其他组织和器官的不良影响。但是，目前已报道的具有棉花纤维特异性的启动子非常有限。因此，棉花纤维特异启动子的克隆，对棉花纤维发育相关基因功能研究和棉花纤维的基因工程改良，具有十分重要的意义。近年来，植物组织器官和发育特异性表达的研究成为植物分子生物学的一个重要研究领域，特别是在植物基因工程的实用化阶段中，为了使目的基因在特定的组织器官和特定的发育阶段优先表达，对组织特异性表达的研究更是成为热点。由于棉花纤维的发育直接影响纤维的品质和产量。因此，研究和筛选纤维特异表达的启动子不仅有助于解析基因表达调控的分子机制，并可为植物基因工程提供有用的调控元件，有着重要的理论意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为改良棉花的纤维品质提供一种新选择。本专利技术的技术方案是棉花纤维特异性表达的启动子TB17P1，具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了还有所述启动子的表达载体。优选的，所述的表达载体是植物表达载体。本专利技术还提供了含有所述表达载体的宿主。具体的，所述的宿主为根癌农杆菌。本专利技术还提供了所述的TB17P1启动子在制备转基因植物中的应用。本专利技术还提供了上述表达载体在制备转基因植物中的应用。具体的，所述的植物为棉花。本专利技术的又一个目的是提供一种利用TB17P1启动子制备转基因植物的方法，包括以下步骤：(1)将所述启动子可操作地插入到表达载体中，构建植物表达载体；(2)将获得植物表达载体转化宿主，获得转化体；(3)将所述转化体转化植物，经培养获得转基因植物。进一步地，本专利技术提供了一种利用TB17P1启动子制备转基因棉花的方法，包括以下步骤：(1)将所述启动子可操作地插入到表达载体中，构建植物表达载体；(2)将植物表达载体转化到棉花的愈伤再生组织中；(3)培养所述棉花愈伤再生组织，经筛选和诱导获得含棉花纤维特异性的启动子的棉花植株。本专利技术中，由于棉花纤维是胚珠外珠被表皮细胞经极性伸长而成，因此纤维细胞是胚珠表皮细胞的一部分。为了筛选棉花纤维特异或优势表达的启动子，专利技术人检测了棉花基因组中12个α-微管蛋白基因和β-19个微管蛋白基因在棉花植株不同组织器官和纤维发育不同时期的表达特性。表达分析的结果显示一个β-微管蛋白基因(GhTUB17)在棉花纤维中特异表达。为了明确GhTUB17基因的启动子在棉花中的表达特性，克隆了该基因5’-上游调控序列962bp，命名为TB17P1。通过克隆和序列分析、构建启动子分析植物表达和棉花遗传转化，以及利用转基因棉花分析GUS活性。明确了TB17P1在棉花中的表达特性：在纤维细胞中特异表达，是一个纤维特异表达启动子。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了微管蛋白基因GhTUB17的启动子(TB17P1)及应用，该启动子是一个棉花纤维细胞特异表达启动子；本专利技术利用基因工程技术成功地分离了棉花纤维特异表达的GhTUB17基因的启动子，所述TB17P1启动子含962bp片段；本专利技术还验证了所述TB17P1启动子序列在棉花中具有纤维表达特异性，能够指导报告基因在棉花纤维中特异性表达，为利用基因工程改良棉花纤维的品质和产量提供了纤维特异性表达的启动子。本专利技术为进一步研究植物基因功能提供了新选择，同时为改良棉花品种和纤维品质提供了有效途径。附图说明图1、A为GhTUB17基因在棉花不同器官和组织中以及纤维和胚珠不同发育时期的表达特性；B为纤维和胚珠不同发育时期的表达特性；其中，误差棒表示3次生物学重复的标准差。FO-0DPA～FO-4DPA:开花后0天的胚珠纤维至开花后4天的胚珠纤维；F-6DPA～F-20DPA:开花后6天的纤维至开花后20天的纤维；O-6DPA～O-20DPA:开花后6天的胚珠至开花后20天的胚珠。图2显示了TB17P1启动子序列上具有的顺式调控元件；其中，序列分析在PlantCare数据库进行(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。图3是pBI121-TB17P1::GUS植物表达载体图谱；其中，LB:T-DNA区段左边界；RB：T-DNA区段右边界；Kanr，卡拉霉素抗性基因；GUS：β-葡萄糖酸苷酶基因；Nos-T:冠瘿碱合成酶基因终止子。图4是启动子分析植物表达载体的酶切验证；其中，M15：DNAMarker15(MBI)；1和2：没有接入TB17P1片段的空载质粒；3:表示已经接入TB17P1片段的pBI121-TB17P1::GUS质粒。图5是扩增验证转基因棉花中的GUS基因；其中，M15：DNAMarker15(MBI)；+：阳性对照(煮沸过的pBI121-TB17P1::GUS农杆菌液)；W：水为模板的扩增产物；-：阴性对照(未转基因棉花)；1-5：转基因后再生的Kan抗性苗，表示T-DNA区段已经整合到转基因棉花基因组中。图6是TB17P1启动子在转基因棉花幼苗中的表达情况；其中，A:整株转基因棉花幼苗；B：下胚轴横切；C:种子根和下胚轴纵切。本图显示TB17P1启动子在种子根、下胚轴和生长点不表达。图7是TB17P1启动子在转基因棉花根中的表达情况；其中，WT:野生型棉花根；TB17P1:pBI121-TB17P1::GUS载体转基因棉花的根；35S:pBI121载体转基因棉花的根；ROOT：根中部；ROOTTIP:根尖。本图显示TB17P1启动子在棉花根中不表达。图8是TB17P1启动子在转基因棉花茎中的表达情况；其中，WT:野生型棉花茎；TB17P1:pBI121-TB17P1::GUS载体转基因棉花的茎；35S:pBI121载体转基因棉花的茎；幼茎的左中右分别是幼茎的纵切、横切和茎节的纵切；老茎的左中右分别是老茎的纵切、横切和茎节的纵切。本图显示TB17P1启动子在棉花茎中不表达。图9是TB17P1启动子在转基因棉花叶中的表达情况；其中，WT:野生型棉花叶片和叶柄；TB17P本文档来自技高网...

【技术保护点】
棉花纤维特异性表达的启动子TB17P1，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2014.11.24 CN 20141068288771.棉花纤维特异性表达的启动子TB17P1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.含有权利要求1所述启动子的表达载体。3.如权利要求2所述的载体，其特征在于：所述的表达载体是植物表达载体。4.含有权利要求2或3所述表达载体的宿主。5.如权利要求4所述的宿主，其特征在于：所述的宿主为根癌农杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗明，翟云兰，李芳，隗廷，曾志锋，肖月华，候磊，裴炎，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85