一种烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用，烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列如SEQID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。本发明专利技术还公开了烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtHMA2基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控烟草镉转运基因NtHMA2的表达，可降低镉从烟草根部转运到叶片的转运率，从而降低烟叶的铬含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。

【技术实现步骤摘要】
一种烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用。
技术介绍
烟草0Vicoiia/?a iaAacw?)是重要的经济作物,是爺科一年生草本植物。烟草属大约有60多种。重金属镉是烟草生长的非必须元素，但容易被吸收，并且通过食物链对人体产生危害。镉随水灌溉和污泥进入土壤中，被土壤吸附的镉一般在(Tl5cm的表层土壤中积累。土壤中过量的镉，不仅能在烟草体内残留，而且也会对烟草的生长发育起明显的危害作用，破坏叶绿体结构，降低叶绿素含量，叶片发黄，光合过程的减弱，生长缓慢，植株矮小，根系受到抑制，生长受阻，产量下降。镉污染对烟草种子出苗、烟草光合特性、烟草体内矿质元素含量、烟草组织结构、烟草酶活性、烟草生长量和烟叶品质均有较大影响。Cd2+的吸收主要是通过一些对Cd2+具有低亲和性的多底物金属离子转运蛋白或通道蛋白进入植物细胞内。例如，小麦的LCTI蛋白在酿酒酵母中表达能够介导Cd2+流入细胞内，并使酵母细胞对Cd2+高度敏感，这种Cd2+高度敏感性可能是由于LCTI蛋白对Cd2+吸收所造成的。另外，金属转运蛋白的Nramp家族也具有能够将Cd2+转运至植物细胞内的功能。酿酒酵母Nramp家族成员SMFl和SMF2蛋白不但能够转运Mn2+而且能够转运Cu2+、Co2+和Cd2+。目前研究表明 ，镉元素从地下部向地上部的转运是借助于膜转运蛋白进行的，例如Pib型ATPase亚家族成员HMA。HMA蛋白家族可以根据转运功能分为两类，即Cu/Ag转运泵和Zn/Cd/Co/Pb转运泵。拟南芥AtHMA2蛋白属于Zn/Cd/Co/Pb转运泵。国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术和基因工程技术对烟草品种进行改良，以提高烟草对镉的抗性，减少烟草对土壤镉的吸收和转运。目前，我国也提出了无公害优质烟的开发计划，为烟草重金属危害的研究提供了新的契机。随着烟草镉污染研究的深入，必将使我国烟草镉污染控制迈上了新的台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种利用生物技术手段降低烟草镉转运率(叶片镉含量/根镉含量)的候选基因，通过基因操作减少烟叶镉含量是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种烟草镉转运基因NtHMA2 ;本专利技术的第二目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法；本专利技术的第三目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA2的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列为SEQ ID:N0.1 所示。本专利技术的第二目的是这样实现的，所述烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法包括以下步骤: A、确定NtHMA2基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA； C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增； D、回收和纯化PCR产物； E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞； F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。本专利技术的第三目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA2用于降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率。本专利技术利用RACE技术从烟草中得到一个烟草镉转运基因NtHMA2，具体步骤为:利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列(NCBI号:FG135138.1);利用此序列比对烟草基因组数据库(行业内部数据库)，获得一个基因序列(Nsyl0129220)，根据此序列设计RACE引物，RACE利用试剂盒Clontech SmartRACE cDNA Amplification Kit进行，反应参考试剂盒说明书；3’端扩增到600bp左右的片段，5’端扩增到500bp左右的片段；目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtHMA2基因的过表达和RNAi植株，对NtHMA2进行功能验证，结果表明NtHMA2基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。NtHMA2基因的发现 ，为通过调控基因的表达，控制烟叶重金属镉含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。【附图说明】图1为利用引物对NtHMA2F/NtHMA2R扩增财.之基因结果，扩增产物4242bp ； 图2为pBI121-NtHMA2载体PCR鉴定，所用引物对为NtHMA2F/NtHMA2R，扩增产物为4242bp ； 图3为pBI121-NtHMA2载体酶切鉴定，利用BamHI和SacI双酶切，可以获得4000bp左右的目的条带； 图4为基因RNAi载体片段PCR扩增结果，所用引物对为HMARNAiF/HMARNAiR，扩增产物为369bp ； 图5为RNAi载体pBI121-pQL1-NtHMA2的酶切验证，XbalI和SacI双酶切后可以将1500bp左右的反向重复单元切下； 图6为NtHMA2 RNAi烟草植株镉转移率，Vector Control为转空载体对照，其余为转基因植株； 图7为过表达烟草植株镉转移率，Vector Control为转空载体对照，其余为转基因植株。【具体实施方式】下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列为SEQ ID:N0.1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID:N0.2所不。所述的烟草镉转运基因NtHMA2来源于林烟草。本专利技术所述所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，包括以下步骤: A、确定NtHMA2基因序列； B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA； C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增； D、回收和纯化PCR产物； E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞； F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。所述的步骤A包括如下步骤:(1)利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列(NCBI号:FG135138.1) ; (2)利用此序列比对烟草基因组数据库(行业内部数据库)，获得一个基因序列(Nsyl0129220)，根据此序列设计RACE 引物;(3)RACE 利用试剂盒 Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit 进行，反应参考试剂盒说明书；3'端扩增到50(T700bp左右的片段，5'端扩增到40(T600bp左右的片段；(4)目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列；其中，步骤(2)所述的RACE基因特异引物为:3' RACE 基因特异引物:5' -AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3'； 5' RACE 基因特异引物:5' -CAACTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草镉转运基因NtHMA2，其特征在于所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种烟草镉转运基因NtHMA2，其特征在于所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列如SEQ ID:N0.1所示。2.根据权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA2，其特征在于所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID:N0.2所示。3.一种权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于包括以下步骤: A、确定NtHMA2基因序列； B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA； C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增； D、回收和纯化PCR产物； E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞； F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。4.根据权利要求3所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于所述的步骤A包括如下步骤: (1)利用同源基因拟南芥AtHMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列；利用此序列比对烟草基因组数据库，获得一个基因序列(Nsyl0129220)，根据此序列设计 RACE 引物,RACE 利用试剂盒 Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit 进行，反应参考试剂盒说明书，3'端扩增到50(T700bp的片段，5'端扩增到40(T600bp的片段； (2)目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文正，王丙武，高玉龙，宋中邦，曾建敏，张家瑞，孔光辉，李永平，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53