代谢进化方法技术

本发明专利技术涉及代谢途径中天然芳族小分子产物的变体的代谢进化方法，其通过采用至少一种基因A的基因嵌合体来体细胞体内组装和重组所述代谢途径，所述方法包括：a)在单个步骤过程中，(i)用与作为细胞基因组的主要部分或存在于基因构建体的框架中的待重组的另一基因的序列同源性小于99.5%的至少一种基因A转化细胞，(ii)重组所述基因，(iii)在靶基因组的整合位点产生所述基因的基因嵌合体，其中所述至少一种基因A在与所述整合位点的5′或3′端锚定的5’端或3’端具有单侧翼靶序列，(iv)重组所述代谢途径的最终的其它基因，和b)选择能够表达所述变体的包括所述基因嵌合体和所述最终的其它基因的克隆，本发明专利技术涉及产生代谢途径中天然芳族小分子产物的变体的细胞文库的制备方法，和由此产生并用于制备所述变体的文库。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及代谢途径中天然芳族小分子产物的变体的，其通过采用至少一种基因A的基因嵌合体来体细胞体内组装和重组所述代谢途径，所述方法包括：a)在单个步骤过程中，(i)用与作为细胞基因组的主要部分或存在于基因构建体的框架中的待重组的另一基因的序列同源性小于99.5%的至少一种基因A转化细胞，(ii)重组所述基因，(iii)在靶基因组的整合位点产生所述基因的基因嵌合体，其中所述至少一种基因A在与所述整合位点的5′或3′端锚定的5’端或3’端具有单侧翼靶序列，(iv)重组所述代谢途径的最终的其它基因，和b)选择能够表达所述变体的包括所述基因嵌合体和所述最终的其它基因的克隆，本专利技术涉及产生代谢途径中天然芳族小分子产物的变体的细胞文库的制备方法，和由此产生并用于制备所述变体的文库。【专利说明】
本专利技术涉及代谢途径中天然芳族小分子产物的变体的，其通过采用基因嵌合体来体细胞体内组装和重组所述代谢途径。
技术介绍
蛋白质设计的首要目标之一是产生具有新的或改进的性质的蛋白质。为在蛋白质或酶上赋予期望活性的能力在化学和制药工业中具有相当大的实际应用。定向蛋白质进化已应运而生，成为蛋白质工程中强有力的技术平台，其中在变体文库中通过实验寻找拥有期望性质的克隆。定向蛋白质进化利用自然选择的力量来进化具有期望性质但未在自然中发现的蛋白质或核酸。多种技术用于产生蛋白质突变体和变体并用于选择期望的功能。重组DNA技术已将单结构基因或整个通路基因转移至适合的替代宿主以便快速繁殖和/或高水平生产蛋白质。活性或其他性质的积累改进通常通过迭代突变和筛选而获得。定向进化的应用主要存在于学术和工业实验室，用以改进蛋白质稳定性并增强酶和有机体的活性或总体性能，或者用以改变酶底物特异性和设计新活性。大多数定向进化工程追求使在农业、医药或工业领域对人类有用的性质(生物催化)进化。整个代谢途径的进化是特别吸引人的概念，这是因为大多数天然和新的化合物是通过途径而不是通过单个酶产生的。代谢途径工程通常需要途径中所有酶的协调操作。新的代谢途径的进化和生物处理的增强通常通过重组和筛选或选择的迭代循环的过程以进化单个基因、整个质粒、多基因簇或者甚至整个基因组来进行。Shao等(I)描述了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中一步法组装编码整个生物化学途径的大型重 组DNA或基因组，其通过在5’和3’端包含相邻片段的5’或3’端序列的两个侧翼(锚定)区的体内同源重组来组装。Elefanty等(2)描述了产生突变小鼠的基因靶向实验，其中IacZ报告基因已敲入至SCL座位。参考图1，示出了采用两个锚定序列，即5’和3’端各一个的SCL-1acZ基因靶向策略。US7807422B2 (3)公开了通过重组微生物生产类黄酮。将一组基因引入异源宿主细胞，以使基因的表达导致酶的产生。Naesby等(4)描述了在酵母中随机组装生物合成途径和生产多种天然产物或中间体。编码七步类黄酮途径的酶的基因被单独地克隆至酵母表达盒中，然后将酵母表达盒随机组合到酵母人工染色体上。类似地，Trantas等(5)能够在酵母质粒中表达编码类黄酮和芪途径的酶的异源基因。定向进化可在活细胞中进行，也称为体内进化，或者可根本不涉及细胞(体外进化)。体内进化具有选择细胞环境中的性质的优势，当将进化的蛋白质或核酸用于生物体时这是有用的。酵母中的体内同源重组已广泛用于克隆、质粒构建和文库建立。通过突变或重组获得文库多样性。DNA改组(DNA shuffling)允许来自多基因的有利突变定向重组。在DNA改组中，DNA序列群随机断裂，然后重组成全长杂合序列。出于同源重组的目的，天然产生的同源基因用作起始多样性的来源。单基因改组文库成员典型地为超过95%的同一性。然而，家族改组允许典型地超过60%同一性的序列的嵌段交换(block exchange)。功能序列多样性来自自然选择存活下来的相关亲本序列；因此，在给定序列中容忍数量大得多的突变而不引入对结构或功能的有害影响。在W01990007576A1(6)中记载了具有多达30%多样性的不同来源的DNA片段的重组。在错配修复缺陷菌或错配修复(MMR)体系暂时失活的细菌中通过属间和/或种间重组而在体内产生杂合基因。因此，避免了修复损伤DNA的那些过程，这将对趋异序列之间的重组频率即部分同源重组产生抑制效果。文库的多样性可通过利用单倍体细胞有效配对而引起二倍体生物形成的能力来增强。在酿酒酵母的营养生命周期中，细胞具有单倍体基因组，即每个染色体以单拷贝存在。在特定条件下，单倍体细胞可配对。借此形成二倍体细胞。二倍体细胞可再次形成单倍体细胞，特别是在特定的营养素缺失的时候。然后它们经历称为减数分裂的过程，随后孢子形成而形成四个单倍体孢子。减数分裂期间，两个亲本基因组的不同染色体重组。减数分裂重组期间，DNA片段交换产生重组的DNA物质。W02005/075654A1 (7)公开了在酿酒酵母中产生重组DNA序列的体系，其基于酿酒酵母的有性生殖周期。杂合二倍体细胞在诱导减数分裂和孢子形成过程的条件下生长。减数分裂通常的特征在于增加遗传重组频率。因此，减数分裂的产物(单倍体细胞或孢子)由于两种不同DNA序列之间的重组而可包含重组DNA序列。通过迭代法，选择重组单倍体后代并彼此配对，所得二倍体再次形成孢子，它们的后代孢子经受适当的选择条件，从而确定新的重组事件。该过程描述于野生型或错配修复缺陷型酿酒酵母细胞中。因此，将感兴趣的两侧各有两个选择标记的基因整合至错配修复缺陷型二倍体菌株的两个姐妹染色体中每一个的同一位点。DNA序列添加到与整合有DNA的基因座的侧翼DNA序列100%同一性的新DNA片段的5’或3’端。这些侧翼靶序列约400-450核苷酸长。然后迫使细胞起始孢子形成。孢子形成期间发生重组过程。所得孢子和重组序列可由选择适当侧翼标记来区分。酵母有效重组同源DNA序列的能力还可用于增加文库的多样性。当享有89.9%同源性的两种基因通过PCR突变并转化至野生型酵母中时，通过体内同源重组建立10e7的嵌合文库，贯穿两种基因显示多个交叉点(8)。尽管已通过工程化重组宿主进行了改进代谢途径来在工业规模上产生小分子的努力，但此类代谢产物的变体仅通过例如造成中间体积累的不完整途径而零星发现。本专利技术的目的为提供作为代谢途径产物的天然芳族小分子的改善的生产方法。该目的通过提供本申请实施方案来实现。
技术实现思路
根据本专利技术，提供代谢途径中天然芳族小分子产物的变体的，其通过采用至少一种基因A的基因嵌合体来体细胞体内组装和重组所述代谢途径来进行，所述方法包括:a)在单个步骤过程中，(i)用与作为细胞基因组的整合部分或存在于基因构建体的框架中的待重组的另一基因的序列同源性小于99.5%的至少一种基因A转化细胞，(ii)重组所述基因，(iii)在靶基因组的整合位点产生所述基因的基因嵌合体，其中所述至少一种基因A在与所述整合位点的5'或3'端锚定的5’端或3’端具有单侧翼靶序列，(iv)重组所述代谢途径的最终的其它基因，和b)选择能够表达所述变体的包括所述基因嵌合体和所述最终的其它基因的克隆。特别优选将选择标记用于基因嵌合体，并根据选择标记的存在来选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁迪·潘查伊坦，萨拉·西巴伊，亚历杭德罗·卢克，
申请(专利权)人：艾威艾基克斯有限公司，
类型：
国别省市：