本发明专利技术公开了一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，检测步骤如下：（1）提取病原微生物基因组和基因组片段化；（2）设计和制备探针；（3）探针与基因组DNA片段进行杂交反应；（4）探针与杂交体固定于丙烯酰胺胶中，电泳去除未杂交上去的片段和未胶连上去的分子；（5）核酸分子固相原位扩增；（6）信号检测，判断病原菌是否存在。本发明专利技术采用单个核苷酸分子捕获、扩增与检测技术，实现了原病微生物快速高效检测的目的，具有十分重要的应用前景和使用价值。本发明专利技术不仅可用于微生物鉴定，还可用于实验室、生产和临床中某些含量较低，且具有重要分析或诊断意义的分子的检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，检测步骤如下：（1）提取病原微生物基因组和基因组片段化；（2）设计和制备探针；（3）探针与基因组DNA片段进行杂交反应；（4）探针与杂交体固定于丙烯酰胺胶中，电泳去除未杂交上去的片段和未胶连上去的分子；（5）核酸分子固相原位扩增；（6）信号检测，判断病原菌是否存在。本专利技术采用单个核苷酸分子捕获、扩增与检测技术，实现了原病微生物快速高效检测的目的，具有十分重要的应用前景和使用价值。本专利技术不仅可用于微生物鉴定，还可用于实验室、生产和临床中某些含量较低，且具有重要分析或诊断意义的分子的检测。【专利说明】—种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术
本专利技术涉及微生物分子检测
，特别是涉及一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术。
技术介绍
食品安全问题越来越受到人们的重视，致病微生物对食品的污染问题历来是人们关注的首要食品安全问题。要从根本上解决食品安全问题，就必须对食品的生产、加工、流通和销售等各环节实施全程管理和监控，这就需要大量能够满足这一要求的快速、方便、准确、灵敏的食品安全分析检测技术，同时一旦发生食源性致病微生物中毒事件，也需要在最短时间内完成检测，以制定科学合理的治疗方案，赢得治疗时间。这些快速分析检测技术的推广应用，不仅是对传统的食品安全分析检测技术的改进和提高，也使食品的质量安全有了进一步的保证。近年来，随着各项科学技术的发展，食品安全快速分析检测技术也得到了一定程度的发展。目前，食品安全快速分析检测方法主要有三类:培养法、免疫学方法和分子生物学方法。培养法是最早发展起来的鉴定细菌的方法。目前，该种方法已改进为在培养基中加入特异性的生化反应底物、抗体、荧光反应底物、酶反应底物等，使目标培养物的选择、分离和鉴定一次性完成。纸片法就是在培养法基础上发展起来的一种新型检测方法。该方法以纸片、纸膜和胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在培养基载体上，通过微生物在培养基和显色物质上的生长、显色来测定食品微生物。目前虽然已有纸片法产品运用于临床检测，但该方法仍存在较多不足之处，如培养检测仍需要较长的检测时间(约24小时)；显色指示剂系统单一，不能对细菌有区别地分类分析；测试纸检测的指标较少，通量低等。由于这些不足，纸片法产品的生产和临床运用仍然较少。免疫学方法通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。酶联免疫吸附法是一种固相酶免疫分析方法，其是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测方法。该方法既可测抗原，也可测抗体，还可以进行定性和定量。但该方法也存在着如检测时间较长、致病菌单克隆抗体难以制备、使用多抗容易产生交叉反应而出现假阳性以及一次只能检测一种或几种致病菌等缺点和不足。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量。但该方法的成本较高，不仅流式细胞仪极为昂贵，而且对操作者的要求也较高。随着分子生物学技术的发展，一些分子生物学检测技术与手段也开始应用于食品致病微生物的检测。实时定量PCR技术是在PCR基础上发展起来的一项新技术，该技术通过直接测定PCR过程中荧光信号的变化，利用电脑分析软件对PCR过程中产生的扩增产物进行动态监测和自动定量，从而成功地实现了 PCR从定性到定量的飞跃。然而，实时荧光定量PCR技术常由于受到寡核苷酸杂交特异性、TaqMan探针比例和染料浓度大等因素的影响，引起定量结果出现偏差或导致假阳性和假阴性结果。基因芯片技术基于芯片上的探针与样品中的靶基因片段之间发生特异性核酸杂交，具有高通量、高灵敏度、准确、快速等特点。其不足之处是芯片技术本身具有较多问题，如特异性问题、假阴性和假阳性问题、芯片的产品质量和可靠性问题等。因此，目前还需要开发可快速、高效检测致病菌的新技术。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，能够快速、高效检测致病菌。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是:提供一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，检测步骤如下: (O分离待检测食品中的微生物，并提取基因组DNA ;采用超声波或DNA破碎酶将上述基因组DNA随机打断成200~1000bp的片段； (2)用DNA合成仪合成一条探针，并用丙烯酰胺对探针进行标记； (3)将步骤(2)中标记后的探针与步骤(1)中打断的基因组DNA片段杂交； (4)将步骤(3)中杂交后的溶液与丙烯酰胺贮存液混合，将均匀混合液平铺于基片上进行凝固形成胶，然后用非变性电 泳液电泳去除未杂交上去的片段和未胶连上去的分子； (5)向步骤(4)中电泳后的胶上滴加核酸分子扩增反应液、核酸荧光染料混合液，将混合液与胶一起密封在基片上并置于控温装置中，进行核酸分子原位扩增； (6)用分辨率高于2048X2048的荧光显微镜或扫描仪进行荧光信号采集，根据阳性点的数量判断待检测样本的病原菌是否存在。在本专利技术一个较佳实施例中，所述病原微生物为细菌、古细菌、真菌、病毒、支原体和藻类，来自于食品、水、空气和患者排泻物。在本专利技术一个较佳实施例中，所述病原微生物是含有特征核酸分子的病原体。在本专利技术一个较佳实施例中，所述特征核酸分子为单链或双链RNA，DNA, cDNA直链核酸分子或环形核酸分子。在本专利技术一个较佳实施例中，所述步骤(3)中的基片为载玻片、硅片或芯片。在本专利技术一个较佳实施例中，所述步骤(5)中的核酸分子原位扩增技术为PCR原位扩增或恒温原位扩增。在本专利技术一个较佳实施例中，所述原位扩增采用原位单分子在三维胶内进行。在本专利技术一个较佳实施例中，所述步骤(5)中的核酸荧光染料为SYBR Green 1、Genefinder 和 Geneview 中的至少一种。在本专利技术一个较佳实施例中，所述核酸分子荧光染料与核酸分子扩增反应混合物一起添加或在扩增反应后添加。本专利技术的有益效果是:本专利技术一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，针对目前市场上对于快速高效病原微生物检测技术的需要，采用单个核苷酸分子捕获、扩增与检测技术，实现了原病微生物快速高效检测的目的，具有十分重要的应用前景和使用价值。本专利技术不仅可用于微生物鉴定，还可用于实验室、生产或临床中某些含量较低，而具有重要分析或诊断意义的分子的检测。。【专利附图】【附图说明】图1是本专利技术一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术的示意图； 图2是单个核酸分子扩增与检测结果图； 附图中各部件的标记如下:1.基因组片段化处理；2.探针与靶向分子在溶液中杂交；3.通过探针上的化学基团将靶向分子与探针的杂交体、以及引物/探针连接固定在固相载体胶中；4.采用电泳等技术将非靶向分子去除；5.采用固相PCR将靶向分子进行单分子原位扩增；6.扩增后的DNA分子簇直接显色后检测；a.细菌基因组DNA ;b.打碎成200-1000bp的非靶向DNA片段；c.打碎成200_1000bp的靶向DNA片段；d.标记有化学基团的探针分子；e.探针与靶向分子的杂交体；f.铺在载玻片或其他固相载体上的丙烯酰胺胶，该胶体中固定有标记了丙烯酰胺分子的引物/探针，以及引本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于食品病原微生物鉴定的单个核酸分子检测技术，其特征在于，检测步骤如下：（1）分离待检测食品中的微生物，并提取基因组DNA；采用超声波或DNA破碎酶将上述基因组DNA随机打断成200～1000bp的片段；（2）用DNA合成仪合成一条探针，并用丙烯酰胺对探针进行标记；（3）将步骤（2）中标记后的探针与步骤（1）中打断的基因组DNA片段杂交；（4）将步骤（3）中杂交后的溶液与丙烯酰胺贮存液混合，将均匀混合液平铺于基片上进行凝固形成胶，然后用非变性电泳液电泳去除未杂交上去的片段和未胶连上去的分子；（5）向步骤（4）中电泳后的胶上滴加核酸分子扩增反应液、核酸荧光染料混合液，将混合液与胶一起密封在基片上并置于控温装置中，进行核酸分子原位扩增；（6）用分辨率高于2048×2048的荧光显微镜或扫描仪进行荧光信号采集，根据阳性点的数量判断待检测样本的病原菌是否存在。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周东蕊，张红琳，白志茂，严勇，陆祖宏，肖鹏峰，李清宁，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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