基于磁性分离和量子点标记的铅中毒快速检测方法与试剂盒技术

本发明专利技术提供一种基于磁性分离和量子点(QDs)标记的液体生物样品中铅的快速检测方法，所述方法包括：1)制备抗铅单克隆抗体；2)将所述抗铅单克隆抗体与纳米磁珠通过共价键偶联，制备抗铅免疫纳米磁珠；3)向所述液体生物样品中加入双功能螯合剂、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，进行温育，之后加入所述抗铅免疫纳米磁珠充分混合，之后进行磁分离，向磁分离得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗体和链霉亲和素化的量子点(QDs)，使用荧光酶标仪进行荧光检测。本发明专利技术还提供一种用于液体生物样品中铅的快速检测的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种基于磁性分离和量子点(QDs)标记的液体生物样品中铅的快速检测方法，所述方法包括：1)制备抗铅单克隆抗体；2)将所述抗铅单克隆抗体与纳米磁珠通过共价键偶联，制备抗铅免疫纳米磁珠；3)向所述液体生物样品中加入双功能螯合剂、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，进行温育，之后加入所述抗铅免疫纳米磁珠充分混合，之后进行磁分离，向磁分离得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗体和链霉亲和素化的量子点(QDs)，使用荧光酶标仪进行荧光检测。本专利技术还提供一种用于液体生物样品中铅的快速检测的试剂盒。【专利说明】基于磁性分离和量子点标记的铅中毒快速检测方法与试剂合Sl
本专利技术属于生物与新医药
。具体地。本专利技术提供了一种基于磁性分离和量子点标记技术快速检测血液中铅含量的方法以及用于快速检测血液中铅含量的试剂盒。
技术介绍
铅(Pb)污染因其具有持久性、生物富集性和毒性而备受关注，一直是国际科学界的热点研究课题之一。近年来，随着我国工业化和城市化进程的加快，铅污染呈上升趋势。通过工业“三废”的排放进入环境的重金属铅，甚至直接影响到了食物链和农产品质量，有很多地方粮食、蔬菜、水果等食物中铅含量严重超标或接近临界值，对人类的健康构成了极大威胁。2012年，刊登在美国《移民与难民研究》杂志上的一份关于“纽约健康和营养检测调查报告”显示，来自中国大陆的移民血液中铅、镉、汞等重金属含量高于来自其他亚洲地区的移民。铅比其他亚洲新移民高出44%。与此同时，在我国一些日用品(如，化妆品)中铅含量严重超标，进一步增加了铅中毒患者的数量。目前，医院检测患者血铅含量的常规方法为光谱法。主要包括:分光光度法(UV)、原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)。尽管这些方法成熟，结果可信度高，样品需要进行复杂的前处理，仪器昂贵，不适合进行快速检测和大量样品的筛选。包括铅在内的重金属快速检测方法目前主要有酶分析法、生物化学传感器法、试纸法和免疫分析法。酶分析法灵敏度高，但选择性较差，对单一重金属离子的检测存在一定的困难。生物化学传感器法发展迅速，灵敏度、自动化程度高，可应用于环境在线监测，但传感器制作工艺较难，成本相对较高。试纸法虽然简单方便，但只能对金属离子进行定性或半定量分析。上述方法主要集中在环境水样的快速检测，而用于生物样品中重金属的快速检测鲜有报道。免疫分析法是检测重金属离子的一种新方法，检测速度快、灵敏度高、选择性强，迄今为止，已经成功用于水中金属离子的检测。使用特异性的双功能螯合剂，可以螯合重金属离子并与载体蛋白偶联，形成完整的免疫原，通过杂交瘤细胞技术制备特异性单克隆抗体。将抗重金属的单克隆抗体连接到新型的Fe3O4磁性纳米颗粒表面，可以使Fe3O4磁性纳米颗粒具有靶向识别和磁性分离的双重功能，从而实现重金属的富集，提高检测灵敏度。量子点(QDs)，又称为半导体纳米微晶粒，是一种直径在I?IOOnm能够接收激发光产生荧光的纳米颗粒。与传统的有机荧光染料相比，QDs具有量子产率高，光化学稳定性高，不易光解等优良的光学特性。将量子点与抗体结合用于荧光免疫分析的报道越来越多，利用亲和素修饰量子点后，量子点可以很容易的与生物素化的抗体结合，为抗体和量子点提供了一种分子连接的桥梁，应用这种方法检测毒素，可以达到用有机染料进行标记的同等的检测限。
技术实现思路
本专利技术应用杂交瘤细胞技术制备铅单克隆抗体(PbMAb);活化的纳米磁珠和QDs分别与PbMAb和二抗相连，制备免疫纳米探针；利用免疫磁珠的可富集特性和QDs荧光信号的变化，以期建立多重信号协同放大、具有超高灵敏度的快速检测人血液中Pb的新方法，具有重要的科学意义和极广阔的应用前景。技术问题:本专利技术的目的在于针对目前尚无的生物样品中重金属Pb的快速检测方法，建立一种利用免疫磁珠高效分离与QDs荧光信号的变化，快速检测血液中Pb含量的分析方法。技术方案:本专利技术提供的基于磁性分离和量子点标记的铅中毒快速检测方法与试剂盒包括如下步骤:l)Pb免疫抗原合成:Pb、双功能螯合剂-(S-S)环己烷-1,2 二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)、血蓝蛋白(KLH)按照一定比例，在三乙胺(TEA)存在下，25°C振荡反应22h ;使用PBS缓冲液洗涤反应产物，并通过超滤管滤掉未反应的小分子物质；使用上述缓冲液稀释抗原，备用。2)Pb检测抗原合成:将Pb、p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA与牛血清白蛋白(BSA)在TEA的作用下合成检测抗原。3)抗Pb单克隆抗体(PbMAb)的制备与纯化:小鼠免疫后制备抗Pb杂交瘤细胞，然后大量制备腹水型PbMAb，最后使用饱和(NH4)2SOjX淀法纯化抗体，使用Sephacry S-300进一步纯化抗体。4)抗Pb免疫磁珠(PbMAb-Fe3O4)制备:将PbMAb与Fe3O4纳米磁珠偶联，制备抗铅免疫磁珠(PbMAb-Fe3O4)。5)检测方法的效果评价:分别通过标准曲线的线性范围，检出限，精密度，加标回收率实验以及与实际样品ICP/MS的检测结果对比，评价方法的准确性与可靠性。有益效果:在我国铅污染严重，建立简便、快速的铅中毒快速检测方法不但对中毒病人的诊断、救治具有重要的理论意义和应用价值，还将对提高我国公共卫生管理水平和公共卫生安全事件处置能力具有重要理论意义和现实意义。本专利技术根据荧光免疫的双抗体夹心原理，利用免疫磁珠分离速度快、效率高、操作简便等优点，结合QDs光化学稳定性高，不易光解等优良的光学特性，分别以免疫磁珠和QDs为载体连接PbMAb和二抗，使得快速、准确地检测生物样品中Pb的含量得以实现。本专利技术仅用100 μ I血，十几微升的试剂，在少于Ih的时间内即可实现对生物样品中铅含量的测定。由于使用的仪器为荧光酶标仪，可以同时检测96个样品，成本低，省时高效。更具体地，本专利技术提供以下各项:1.用于液体生物样品中铅的快速检测的试剂盒，所述试剂盒包含:抗铅免疫纳米磁珠，所述抗铅免疫纳米磁珠通过将抗铅单克隆抗体与纳米磁珠经由共价键偶联制备；双功能螯合剂；牛血清白蛋白(BSA)；三乙胺(TEA)；生物素化的BSA抗体；和链霉亲和素化的QDs。2.根据I所述的试剂盒，其中所述纳米磁珠是Fe3O4纳米磁珠。3.根据I所述的试剂盒，其中所述纳米磁珠的粒径为280nm。4.根据I所述的试剂盒，其中所述双功能螯合剂是p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA。5.根据I所述的试剂盒，其中所述液体生物样品选自尿液或血液。6.根据I所述的试剂盒，其中所述液体生物样品是血液。7.根据I所述的试剂盒，其中所述抗铅单克隆抗体利用铅免疫抗原制备，所述铅免疫抗原通过在三乙胺(TEA)的存在下将铅、双功能螯合剂(优选为p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)和血蓝蛋白(KLH)混合来制备。8.根据I所述的试剂盒,其中用于所述QDs的激发波长=405nm,发射波长=585nm。9.基于磁性分离和量子点(QDs)标记的液体样品中铅的快速检测方法，所述方法包括:I)制备抗铅单克隆抗体；2)将所述抗铅单克隆抗体与纳米磁珠通过共价键偶联，制备抗铅免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于液体生物样品中铅的快速检测的试剂盒，所述试剂盒包含：抗铅免疫纳米磁珠，所述抗铅免疫纳米磁珠通过将抗铅单克隆抗体与纳米磁珠经由共价键偶联制备；双功能螯合剂；牛血清白蛋白(BSA)；三乙胺(TEA)；生物素化的BSA抗体；和链霉亲和素化的QDs。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙志伟，黄沛力，孙湖泊，王萌萌，王吉龙，王晖，郝凤桐，李惠玲，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京;11