纳洛酮的酶法制备及其药物组合物制造技术

本发明专利技术提供了酶法制备纳洛酮的方法，其中酶反应条件温和，对人体基本无害。另外，本发明专利技术还提供了由该方法制备获得的纳洛酮组合物及其应用，尽管该组合物中含有14-羟基-7,8-二氢可待因酮杂质，但是不影响其成药性能。还有，本发明专利技术还提供了纳洛酮组合物的鉴定方法以及制备中所用的酶等。

【技术实现步骤摘要】
纳洛酮的酶法制备及其药物组合物
本专利技术属于医药
，具体而言，本专利技术涉及酶法制备的纳洛酮组合物，尽管含有杂质，但是不影响其成药性能。
技术介绍
纳洛酮，化学名称为17-烯丙基-4，5a_环氧基-3，14-二羟基吗啡喃_6_酮，通常以盐酸盐的形式成药，是阿片受体的拮抗剂，主要用于逆转由于吗啡类物质(毒品)造成的麻醉性镇痛以及呼吸抑制，并且能用于解救乙醇等物质引起的中毒等。近年来，对纳洛酮的研究主要着眼于其药物制剂和与其它药物的联用上，如参见中国专利(申请)03807796.5、200680005969.1、200510080479.5、201180023192.2、200880006847.3 等。另外，中国专利(申请)200710039118.5 和 201010211706.4 涉及纳洛酮及其中间体的制备技术，但是仍旧采用化学合成技术，没有跳出80年代以来利用氢溴酸或者氯甲酸等来合成的框架，即，以蒂巴因为原料，氧化氢化产生14-羟基-7，8- 二氢可待因酮，然后经过复杂的过程，在添加保护基的条件下，利用氢溴酸或者氯甲酸等试剂来脱甲基，然后脱除保护基，最后经烷基化来生成纳洛酮，其中反应(尤其是脱甲基过程)条件剧烈，试剂及其残留对人体危害大。本专利技术人最终获得了一种能够识别立体稠环系的脱甲基酶，能够在温和条件下将14-羟基-7，8- 二氢可待因酮转化成14-羟基-7，8- 二氢降吗啡酮，从而可以直接经烷基化来生成纳洛酮。另外，清除共沉淀/结晶的14-羟基-7，8-二氢可待因酮杂质会带来较大损失，而本专利技术人研究发现，如果不清除杂质而直接烷基化生成纳洛酮，得到的纳洛酮纯度仍旧大于97%，符合药用要求，而其中14-羟基-7，8- 二氢可待因酮杂质并不对其直接成药构成影响，因而作为药物可以进一步降低原料药成本。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的制备纳洛酮的方法，其中使用了现有技术所没有提示的酶，使得酶反应条件温和，对人体基本无害。另外，本专利技术还提供了由该方法制备获得的纳洛酮组合物及其应用，尽管该组合物中含有杂质，但是不影响其成药性能。还有，本专利技术还提供了纳洛酮组合物的鉴定方法以及制备中所用的酶等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了酶法制备纳洛酮的方法，其包括，(A)任选将蒂巴因氧化氢化成14-羟基-7，8- 二氢可待因酮；(B)在脱甲基酶的作用下，将14-羟基-7，8- 二氢可待因酮生成14-羟基_7，8_ 二氢降吗啡酮纯度高并含14-羟基-7，8- 二氢可待因酮的组合物，其中所述脱甲基酶的氨基酸序列:(1)如 SEQ ID No: 2 所示，或(2)是对SEQ ID No: 2缺失、添加和/或取代一个或几个氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:2活性的序列；(C)将步骤(B)获得的组合物中的14-羟基-7，8-二氢降吗啡酮烷基化成纳洛酮，获得纳洛酮纯度高并含14-羟基-7，8- 二氢可待因酮的组合物；和，(D)任选进一步纯化和/或盐酸化步骤(C)获得的组合物。这是首次报道的酶法参与制备纳洛酮的方法，其中使用了脱甲基酶，其氨基酸序列:(I)如SEQ ID No:2所示，或(2)是对SEQ ID No:2缺失、添加和/或取代一个或几个氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:2活性的序列。在本文中，“任选”具有其词典意义，即选择或者不选择。例如，本专利技术第一方面的方法可以选择包括步骤(A)，以蒂巴因(Thebaine)为原料来制备纳洛酮；也可以选择不包括步骤(A)，以14-羟基-7，8-二氢可待因酮为原料来制备纳洛酮。通常优选前者。又如，本专利技术第一方面的方法可以选择包括步骤(D);也可以选择不包括步骤(D)，即产生纳洛酮纯度高并含14-羟基-7，8-二氢可待因酮的组合物即可。本专利技术优选后者，不优选前者，因为本专利技术人发现，纳洛酮纯度高并含14-羟基-7，8-二氢可待因酮的组合物已经可以直接作为药物原料而成药，甚至可能对成药性质有益，无需昂贵的后期纯化过程(从纳洛酮中去除少量14-羟基-7，8-二氢可待因酮需要昂贵的层析分离过程)。所以，本专利技术第一方面的方法可以是酶法制备纳洛酮纯度高并含14-羟基-7，8-二氢可待因酮的组合物的方法。在本文中，如无相反指示，组合物中成分的“纯度”和“含量”可以互换使用，都是指该成分在组合物中所占的比重，这通过HPLC的面积归一法就能方便地计算。本专利技术第一方面的方法制备的纳洛酮纯度高并含14-羟基-7，8-二氢可待因酮的组合物中纳洛酮纯度高，优选在本专利技术第一方面的方法中，在步骤(C)获得的组合物中，纳洛酮的纯度大于95%，优选大于96%，更优选大于97%，如大于97.5%。由于纳洛酮纯度高，在步骤(C)获得的组合物中的14-羟基-7，8-二氢可待因酮的含量就低。优选在本专利技术第一方面的方法中，在步骤(C)获得的组合物中，14-羟基-7，8-二氢可待因酮的含量小于5%，优选小于4%，更优选小于3%，如小于2.5%。14-羟基-7，8- 二氢可待因酮的含量用酶法制备无法避免，“含14-羟基-7，8- 二氢可待因酮”的表述已经表明组合物中14-羟基-7，8- 二氢可待因酮的含量不为0，为了更清楚起见，14-羟基-7，8- 二氢可待因酮的含量下限可以为0.3%。也优选在本专利技术第一方面的方法中，在步骤(A)中，蒂巴因在甲酸中被过氧化氢氧化成14-羟基可待因酮，然后14-羟基可待因酮被氢气氢化成14-羟基_7，8-二氢可待因酮。其中优选氢气氢化的催化剂是Pd/C。另外，优选14-羟基可待因酮和/或14-羟基_7，8- 二氢可待因酮都可以在碱性溶液中沉淀提取，更优选其中碱性溶液的pH为8.0~9.0，尤其是8.1~8.5，如8.2。优选在本专利技术第一方面的方法中，在脱甲基酶的作用下，将14-羟基-7，8- 二氢可待因酮在酸性含半胱氨酸的溶液中生成14-羟基-7，8- 二氢降吗啡酮纯度高并含14-羟基-7，8-二氢可待因酮的组合物。优选其中酸性的pH值为5.5~6.3，如6.0。另外优选脱甲基酶反应的温度为20~33°C，尤其是25~30°C，如28°C ;和/或，优选脱甲基酶反应的时间为I~10小时，优选为3~8小时，如5小时。为了避免本专利技术的脱甲基酶的降解活性，提高原料利用率，反应温度不可高于35°C。另外还优选步骤(B)获得的组合物可以在碱性溶液中沉淀提取，更优选其中碱性溶液的pH为8.0~9.0，尤其是8.3~8.3，如8.5。这样，在步骤(B)获得的组合物中，尽管无法除去14-羟基-7，8-二氢可待因酮杂质，但是可以使其含量对最终成药已经不构成影响，甚至可能有益。优选在本专利技术第一方面的方法中，在步骤(B)获得的组合物中，14-羟基-7，8- 二氢降吗啡酮的纯度大于90%，优选大于92%，更优选大于93%，如大于93.5%。相应地，优选在本专利技术第一方面的方法中，在步骤(B)获得的组合物中，14-羟基-7，8- 二氢可待因酮的含量小于10%，优选小于8%，更优选小于7%，如小于6%。所以，优选在本专利技术第一方面的方法中，步骤(B)不包括对步骤(B)获得的组合物进一步提纯的步骤。这样直接使用步骤(B)获得的组合物可以进一步增加成本优势。另外优选在本专利技术第一方本文档来自技高网...

【技术保护点】
酶法制备纳洛酮的方法，其包括，（A）任选将蒂巴因氧化氢化成14‑羟基‑7,8‑二氢可待因酮；（B）在脱甲基酶的作用下，将14‑羟基‑7,8‑二氢可待因酮生成14‑羟基‑7,8‑二氢降吗啡酮纯度高并含14‑羟基‑7,8‑二氢可待因酮的组合物，其中所述脱甲基酶的氨基酸序列：（1）如SEQ ID No:2所示，或（2）是对SEQ ID No:2缺失、添加和/或取代一个或几个氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:2活性的序列；（C）将步骤（B）获得的组合物中的14‑羟基‑7,8‑二氢降吗啡酮烷基化成纳洛酮，获得纳洛酮纯度高并含14‑羟基‑7,8‑二氢可待因酮的组合物；和，（D）任选（但并不优选）进一步纯化和/或盐酸化步骤（C）获得的组合物。

【技术特征摘要】
1.酶法制备纳洛酮的方法，其包括， (A)任选将蒂巴因氧化氢化成14-羟基-7，8-二氢可待因酮； (B)在脱甲基酶的作用下，将14-羟基-7，8-二氢可待因酮生成14-羟基-7，8- 二氢降吗啡酮纯度高并含14-羟基-7，8- 二氢可待因酮的组合物，其中所述脱甲基酶的氨基酸序列: (1)如SEQ ID No:2 所示，或 (2)是对SEQID No:2缺失、添加和/或取代一个或几个氨基酸残基而获得的保留SEQID No:2活性的序列； (C)将步骤(B)获得的组合物中的14-羟基-7，8-二氢降吗啡酮烷基化成纳洛酮，获得纳洛酮纯度高并含14-羟基-7，8- 二氢可待因酮的组合物；和， (D)任选(但并不优选)进一步纯化和/或盐酸化步骤(C)获得的组合物。2.权利要求1所述的方法，其中，在步骤(C)获得的组合物中，纳洛酮的纯度大于95%，优选大于96%，更优选大于97%，如大于97.5% ;或，在步骤(C)获得的组合物中，14-羟基_7，8- 二氢可待因酮的含量小于5%，优选小于4%，更优选小于3%，如小于2.5% ;或，在步骤(C)中，14-羟基-7，8- 二氢降吗啡酮被溴丙烯烷基化成纳洛酮。3.权利要求1所述的方法，其中，在步骤(A)中，蒂巴因在甲酸中被过氧化氢氧化成14-羟基可待因酮，然后14-羟基可待因酮被氢气氢化成14-羟基_7，8-二氢可待因酮。4.权利要求1所述的方法，`其中，在步骤(B)获得的组合物中，14-羟基-7，8-二氢降吗啡酮的纯度大于90%，优选大于92%，更优选大于93%，如大于93.5%...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，杨春玮，
申请(专利权)人：奇方天津医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12