分析方法技术

本发明专利技术提供了用于高半胱氨酸的基于盒的自动化分析。本发明专利技术涉及分析血液中高半胱氨酸的方法和用于这种方法的分析试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
分析方法本申请是申请日为2006年2月23日、申请号为200680006015.2、专利技术名称为“分析方法”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术涉及分析血液中高半胱氨酸的方法和用于这种方法的分析试剂盒。高半胱氨酸（HCy）是小的含硫α氨基酸，不用于蛋白质合成，但以低浓度存在于细胞和细胞外液中，例如在成年人血浆中一般约10μM。提高的血浆HCy水平与叶酸或维生素B缺乏以及与心血管疾病相关。因而在分析血浆中的HCy中存在着重要临床意义。由Axis-ShieldASA开发了一种这样的分析系统，可以从AbbottLaboratories商业地获得。在销售的前六年中，已经使用这个系统进行了超过2600万这种HCy分析。Axis-Shield/AbbottHCy分析包括将血浆中的HCy酶转化成S-腺苷基-高半胱氨酸（SAH）和对SAH的免疫分析检测。然而Axis-Shield/AbbottHCy分析被设计在临床实验室中进行，仍然需要一种HCy分析，其是即时(point-of-care)可进行的形式，例如，在医师的办公室中进行，使得患者不必重新访问来获知分析的结果。能够在即时使用的分析执行设备近来已经由Axis-ShieldASA开发。这是可以商业上获得的(商标Afinion)，并在例如WO02/090995中进行了描述，在此引用其内容作为参考。在Afinion系统中，样品（例如，血液、血浆、尿，等等）被置于分析盒中，其含有预先加载了进行分析所需的试剂的几个孔，并带有计算机可读的信息，足以允许设备来确定对于特定的样品类型和目标被分析物如何进行分析。我们现在已经开发了即时能够进行的血浆HCy分析，例如，使用Afinion设备，使用全血，即，不需要从血液样品分离细胞。使用全血而不是血浆的能力大大地简化了医师所需的样品操作。然而使用全血产生了关于血浆HCy分析性能的严重难题，因为样品中的细胞内HCy可能潜在地漏入血浆中。实际上，对于血浆HCy的当前的临床实验室分析，医师被指示从全血中分离血浆，并在30分钟内冷冻保存血浆样品，以避免被细胞内HCy污染。细胞内HCy造成的污染必需避免，因为正常/异常血液HCy的当前标准是对于血浆HCy的，还不知道患者之间在细胞内HCy中存在多少差异，以及根据患者的健康状况这种差异有多少。然而，我们现在发现，通过延迟细胞裂解直到发生结合，并通过校正血细胞比容，有可能在血浆HCy的酶免疫分析中使用未分离的全血样品。因而，从本专利技术的一个方面考虑，提供了分析采自人类或形成血管的非人动物受试者的血液样品中血浆高半胱氨酸的方法，所述方法包括：用以下试剂接触来自所述受试者的全血样品——液体稀释剂、还原剂、高半胱氨酸-转化酶、任选的所述酶的高半胱氨酸转化反应的抑制剂、细胞裂解剂、能够与所述高半胱氨酸转化酶的转化产物结合的颜色标记的结合剂，和能够与所述转化产物竞争与所述结合剂的结合的颗粒；在用所述试剂接触后，抽吸所述样品通过具有孔隙的膜，所述孔隙足以使所述结合剂在其未结合状态时和当与所述转化产物结合时通过，但不足以容许与所述颗粒结合时的所述结合剂通过；检测保持在所述膜上的所述结合剂的颜色标记；通过应用取决于所述全血样品中红细胞浓度的校正因子，由此确定血浆高半胱氨酸浓度的指标；以及任选的但是优选的，将所述血浆高半胱氨酸浓度表示为可视的或电子的信号；其中与所述试剂接触在如下情况下是相继的或同时的：i）在与所述稀释剂、酶和还原剂接触后发生与所述裂解剂的接触；ii）当抑制剂存在时，与抑制剂的接触发生在与所述稀释剂、酶和还原剂接触之后，但不晚于与所述裂解剂的接触；以及iii）与所述结合剂和所述颗粒的接触不包括与含有所述结合剂和所述颗粒两者的液体接触。在本专利技术的方法中，优选的是在细胞裂解开始前（或同时）采取步骤来终止或至少减慢高半胱氨酸转化酶的HCy转化。这可以通过改变样品温度，例如，来减慢酶反应或使酶变性，或通过稀释，或通过改变pH值，或通过添加用来抑制反应或使酶变性的试剂（例如，使用洗涤剂如SDS、离液盐例如NaSCN，或其他已知的变性剂，例如尿素或氯化胍(guanidiniumchloride)，或金属或辅助因子（co-factor）结合剂（其中所述酶反应需要金属或辅助因子））来实现。当使用变性洗涤剂时，这也可以起到裂解剂的作用。为了方便起见，干扰酶的HCy转化反应的这种试剂在此是指抑制剂，在本专利技术方法的优选的实施方式中，抑制剂被包含在一系列使用的试剂中。在本专利技术的方法中，与试剂接触优选包括孵育预定时间，和优选的在预定的温度以两个阶段进行，首先进行与稀释剂、还原剂和酶的接触，其次和随后，进行与颗粒和结合剂接触。在第一优选的实施方式中，接触顺序如下：i）与稀释剂接触，ii）与酶和还原剂接触，iii）孵育，iv）与颗粒、抑制剂和裂解剂接触，v）与结合剂接触，vi）孵育，以及vii）抽滤(draw)过膜。在第二的、更优选的实施方式中，接触顺序如下：i）与稀释剂接触，ii）与还原剂、酶和颗粒接触，iii）孵育，iv）与裂解剂、抑制剂和结合剂接触，v）孵育，以及vi）抽滤过膜。在第三优选的实施方式中，接触顺序如下：i）与稀释剂接触，ii）与还原剂、酶和颗粒接触，iii）孵育，iv）与裂解剂和抑制剂接触，v）与结合剂接触，vi）孵育，以及vii）抽过膜。一般地，优选的是，试剂存在于单次使用(single-use)的、多孔的(multi-walled)分析盒中。特别优选的，这种盒应含有试剂、顶端具有膜的移液管、和可移动的顶端为毛细管的移液管。在这种盒中，特别优选的是至少结合剂和酶，优选的颗粒还以干燥形式存在，结合剂和颗粒存在于独立的孔中。因而，从本专利技术的进一步的方面考虑，提供了单次使用的盒，用于使用全血进行血浆高半胱氨酸分析，所述盒具有多孔的底座、可移动的顶端为毛细管的移液管和盖子，所述盖子带有顶端有膜的的移液管，以及所述底座的孔含有以下的分析试剂：液体稀释剂；还原剂；高半胱氨酸转化酶；任选的，所述酶的高半胱氨酸转化反应的抑制剂；细胞裂解剂；能与所述酶的转化产物结合的、颜色标记的结合剂；以及能与所述转化产物竞争与所述结合剂结合的颗粒；所述结合剂和所述颗粒处在不同的所述孔中；当抑制剂存在时，所述抑制剂和所述酶存在于不同的所述孔中，所述裂解剂存在于不同于含有所述酶和至少部分的所述还原剂和所述稀释剂的一个或多个孔的孔中。在第一优选的实施方式中，所述盒包括至少四个孔，第一个含有稀释剂，第二个含有酶和还原剂，第三个含有颗粒、裂解剂和抑制剂，第四个含有结合剂。在第二优选的实施方式中，所述盒包括至少四个孔，第一个含有稀释剂，第二个含有稀释剂、抑制剂和裂解剂，第三个含有酶、还原剂和颗粒，第四个含有结合剂。在第三优选的实施方式中，所述盒包括至少四个孔，第一个含有稀释剂，第二个含有酶、还原剂和颗粒，第三个含有稀释剂、抑制剂和裂解剂，第四个含有结合剂。这三种盒形式特别适合于进行以上列出的优选的接触顺序。本专利技术的盒的孔，当它们含有液体时，优选的具有可移动的或可打孔的封闭物(closure)，例如，箔封盖。盖子优选的包括钻孔器(piercer)用于刺穿这种封盖，优选的形成可容纳可移动的移液管的形状，移液管本身可用于采集全血样品用于导入盒中。在使本文档来自技高网...

【技术保护点】
高半胱氨酸‑转化酶在制备用于分析采自人类或形成血管的非人动物受试者的全血样品中血浆高半胱氨酸的试剂盒中的用途，所述分析包括：用以下试剂接触来自所述受试者的全血样品—液体稀释剂、还原剂、高半胱氨酸‑转化酶、所述酶的高半胱氨酸转化反应的抑制剂、细胞裂解剂、能够与所述高半胱氨酸转化酶的转化产物结合的颜色标记的结合剂，和能够与所述转化产物竞争与所述结合剂结合的颗粒；在用所述试剂接触后，抽吸所述样品通过具有多孔性的膜，所述多孔性足以使所述结合剂在其未结合状态时和当与所述转化产物结合时通过，但不足以使与所述颗粒结合时的所述结合剂从此通过；检测保持在所述膜上的所述结合剂的颜色标记；通过应用取决于所述全血样品中红细胞浓度的校正因子，由此确定血浆高半胱氨酸浓度的指标；其中与所述试剂接触在如下情况下是相继的或同时的：i）在与所述稀释剂、酶和还原剂接触后发生与所述裂解剂的接触；ii）当抑制剂存在时，与抑制剂的接触发生在与所述稀释剂、酶和还原剂接触之后，但不晚于与所述裂解剂的接触；以及iii）与所述结合剂和所述颗粒的接触不包括与含有所述结合剂和所述颗粒的液体接触。

【技术特征摘要】
2005.02.24 GB 0503836.91.一种分析在血浆中和在血细胞中存在的被分析物的方法，所述方法包括(a)测定所述被分析物在全血样品的血浆中的含量，其中不从所述全血样品分离源自该全血样品的细胞，(b)分光光度测定所述样品的血细胞比...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗兰克弗朗策恩，阿恩L法伦，阿恩K诺德海，
申请(专利权)人：阿克西斯希尔德公司，
类型：发明
国别省市：挪威;NO