本发明专利技术公开了一种靶向性的载基因免疫磁性白蛋白纳米球及制备方法，先用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球：将质粒与磁性纳米粒孵育30min，得到质粒/纳米粒复合物，此复合物再与牛血清白蛋白的溶液混匀，用无水乙醇滴至溶液呈胶状。离心后沉淀即为载基因磁性白蛋白纳米球。接着用异型双功能交联剂将单抗西妥昔连接至载基因磁性白蛋白纳米球表面，即得到具有靶向性的免疫磁性白蛋白纳米球。本发明专利技术制得的纳米球经免疫方法检测具有免疫特性，并在体外检测其对肺癌细胞GLC-82的靶向性，结果显示出了良好的靶向性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗肿瘤的靶向药物研究领域，具体涉及一种。
技术介绍
(I) Survivin-siRNA (生存素基因的干扰RNA)在肿瘤治疗中的应用Survivin是新近克隆的凋亡抑制基因，survivin蛋白是迄今发现的分子最小、而功能最强的凋亡抑制蛋白(inhibitor ofapoptosis protein, IAP)。其表达部位十分特殊，只表达于胚胎和发育的胎儿组织，不见于终末分化的正常成人组织(胸腺和生殖腺除外)；但在体外培养的癌细胞及人类大多数肿瘤组织内有survivin的表达，如肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等。研究也表明，survivin基因能够抑制细胞的凋亡，且可能在肺癌的发生发展中起着重要作用；因此，封闭或下调survivin基因的表达水平，恢复正常凋亡调控机制，成为肺癌基因治疗的新思路。RNA干扰(RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA (double-strandedRNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是一种序列特异性的转录后基因沉默机制。近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《科学》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并列为2002年 十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。跟传统的基因治疗技术相比，RNA干扰在基因功能和相关方面的研究中具有许多特点和优势。最显著的特征就是只引起与双链RNA同源的mRNA降解，而对其他无关基因的表达影响，具有高度的特异性及祀向性(Cheng S Q, Wang W L, Yan ff, et al.Knockdownof survivin gene expression by RNAi induces apoptosis in human hepatocellularcarcinoma cell line SMMC-7721[J].World J Gastroenterol,2005,11 (5):756-759.)。这正是目前分子靶向治疗恶性肿瘤所需要的。(2)白蛋白纳米球作为载体的应用传统的抗肿瘤药物是通过各种途经给药后，达到一定的血药浓度分布于全身而产生治疗作用。这种治疗方法最大的缺陷是缺乏选择性，体内药物行为由其理化性质及身体解剖/生理学特点决定。大多数常用抗肿瘤药物分子量低，在体内容易扩散，导致相对平均的组织分布。往往在治疗的同时产生毒副作用，严重影响这些药物的抗肿瘤治疗价值。白蛋白是一种天然的可生物降解的高分子材料，具有无数的网状空隙，为镶嵌携带药物创造了有利的空间条件，因而作为药物载体尤其是抗肿瘤药物的载体受到国内外研究者的广泛关注。白蛋白微球就是由人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)制备，是化学性能稳定、无毒、无免疫原性和生物相容性好的一种理想的载药微球(樊继波，陈永斌，周洁，等.白蛋白微球的制备方法及质量评价的研究进展[J].天津药学，2009，21 (3):58-61.)。白蛋白纳米球则是以白蛋白为基质的纳米级微粒，白蛋白微纳米球在药物输送方面具有其独特的优越性:(1)可缓释药物，延长药物在体内作用时间；(2)可实现靶向输送的目的；(3)可在保证药物作用的前提下，减少给药剂量，从而减轻或避免毒副反应；(4)可提高药物的稳定性，有利于储存；(5)可用以建立一些新的给药途径，包括体内局部给药、黏膜吸收给药、多月太类药物的口服给药等(Felix Kratz.Albumin as a drug carrier:Design of prodrugs,drug conjugates and nanoparticles[J]Journal of Controlled Release，2008，132:171 - 183.)。所以，纳米控释系统是一种非常有前途的药物新剂型，对其研究也越来越深入，用途也会越广泛。 (3)抗原-抗体系统介导的靶向治疗主要是利用抗原-抗体之间的特异性识别机制发挥主动靶向特定细胞作用的给药系统。许多抗体对大多数肿瘤如肝癌、卵巢癌、结肠癌等的特异性抗原具有识别作用，重组细胞工程的发展也使肿瘤抗体的低成本工业化生产成为可能。许多常用抗肿瘤药物被用于制备单克隆抗体-载药微粒的偶联物，即免疫微粒，是以肿瘤特异性抗体为导向载体，药物吸附或包封在白蛋白等生物可降解材料中经化分离而成的粒径为纳米级的胶态固体颗粒，其载药量较大，具缓释药物性，能通过抗体特异性导向现对癌细胞主动选择性结合杀伤。西妥昔为人鼠嵌合型抗EGFR (EGFR为表皮生长因子受体)单克隆抗体，由美国礼来公司原研，德国默克和美国施贵宝公司开发，2003年在瑞士首先上市。目前已批准适应证为肠癌、头颈部癌和鳞状细胞癌，用于肺癌尚处于注册前阶段。与抑制EGFR酪氨酸激酶的一些小分子化合物(易瑞沙，埃罗替尼等)比较，该药的最大特点是无论单药治疗还是与放疗或与化疗联合，都能在EGFR表达阳性的癌细胞发挥明显的抗癌作用，显著增加放疗或化疗的疗效。因此将偶联在药物载体系统的表面，对高表达EGFR的癌细胞有特异性的抗原-抗体识别机制，从而实现靶向治疗的目的。
技术实现思路
技术问题:本专利技术提供一种集中运用了磁性白蛋白纳米及免疫纳米球的特点，在白蛋白纳米球表面偶联单抗的具有靶向性的载基因免疫磁性白蛋白纳米球，同时提供了一种该磁性白蛋白纳米球的制备方法。技术方案:本专利技术具有靶向性的载基因免疫磁性白蛋白纳米球的制备方法，包括如下步骤:I)制备载基因磁性白蛋白纳米球:按照质量比30:1-50:1称取聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4磁性纳米粒悬液与质粒survivin-siRNA,将两者混合后孵育30分钟以上，得到聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4/survivin-siRNA 复合物；按照聚乙烯亚胺修饰的Fe304/survivin-siRNA复合物与牛血清白蛋白粉质量比1:5~3:5，将前者放入牛血清白蛋白溶液中，搅拌混匀，调节pH值至9 ;一边搅拌，一边将乙醇缓慢滴至上述混合溶液中，直至溶液呈凝胶状，得到纳米粒溶液；按照牛血清白蛋白与25%戍二醒溶液质量体积比2mg/ ii I~4mg/ ii I,向纳米粒溶液中缓慢滴加25%戊二醛溶液，磁力搅拌12~24小时，使纳米粒交联固化，制得固化的载基因磁性白蛋白纳米球溶液；将载基因磁性白蛋白纳米球溶液高速离心，倾去上清液，超声分散，洗涤3次以上，即得到载基因磁性白蛋白纳米球；2)采用SPDP交联法进行鼠抗人EGFR单克隆抗体与载基因磁性白蛋白微球的偶联，具体步骤如下:取鼠抗人EGFR单克隆抗体，溶于0.01~0.lmol/L磷酸盐缓冲液中，以鼠抗人EGFR单克隆抗体与SPDP摩尔比1: 15，将鼠抗人EGFR单克隆抗体溶液加入15~25mmol/L的SPDP的乙醇溶液中，反应60min以上，将反应混合物用pH4~5的醋酸盐缓冲液透析，在得到的带吡啶二硫基的单克隆抗体溶液中加入二硫苏糖醇，二硫苏糖醇与SPDP的质量比大于100:1，搅拌30分钟以上，然后以磷酸盐缓冲液为透析液进行透析，得到带巯基的鼠抗人表皮生长因子受体的单克隆抗体溶液；将载基因磁性白蛋白纳米球悬液超声分散在PH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有靶向性的载基因免疫磁性白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：?1）制备载基因磁性白蛋白纳米球：按照质量比30:1?50：1称取聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4磁性纳米粒悬液与质粒survivin?siRNA，将两者混合后孵育30分钟以上，得到聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4/survivin?siRNA复合物；按照聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4/survivin?siRNA复合物与牛血清白蛋白粉质量比1：5~3：5，将前者放入牛血清白蛋白溶液中，搅拌混匀，调节pH值至9；一边搅拌，一边将乙醇缓慢滴至上述混合溶液中，直至溶液呈凝胶状，得到纳米粒溶液；按照牛血清白蛋白与25%戊二醛溶液质量体积比2mg/μl?~4mg/μl，向所述纳米粒溶液中缓慢滴加25%戊二醛溶液，磁力搅拌12~24小时，使纳米粒交联固化，制得固化的载基因磁性白蛋白纳米球溶液；将所述载基因磁性白蛋白纳米球溶液高速离心，倾去上清液，超声分散，洗涤3次以上，即得到载基因磁性白蛋白纳米球；2）采用SPDP交联法进行鼠抗人EGFR单克隆抗体与载基因磁性白蛋白微球的偶联，具体步骤如下：取鼠抗人EGFR单克隆抗体，溶于0.01~0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，以鼠抗人EGFR单克隆抗体与SPDP摩尔比1：15，将鼠抗人EGFR单克隆抗体溶液加入15~25?mmol/L的SPDP的乙醇溶液中，反应60min以上，将反应混合物用pH4~5的醋酸盐缓冲液透析，在得到的带吡啶二硫基的单克隆抗体溶液中加入二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇与SPDP的质量比大于100:1，搅拌30分钟以上，然后以磷酸盐缓冲液为透析液进行透析，得到带巯基的鼠抗人表皮生长因子受体的单克隆抗体溶液；将载基因磁性白蛋白纳米球悬液超声分散在PH4~5的醋酸盐溶液中，然后按照载基因磁性白蛋白纳米球与SPDP质量比为10：1~20：1，搅拌下滴加SPDP乙醇溶液，高速离心后，用Hank’s液洗涤，得到活化的磁性白蛋白纳米粒；按照活化的磁性白蛋白纳米粒与带巯基的鼠抗人表皮生长因子受体的单克隆抗体质量比为20：1~30：1，将两者的溶液混合，轻摇反应15小时以上，高速离心后，用Hank’s液洗涤，得到单克隆抗体偶联的载基因磁性白蛋白纳米球悬液，即为载基因免疫磁性白蛋白纳米球。...
【技术特征摘要】
1.一种具有靶向性的载基因免疫磁性白蛋白纳米球的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤: 1)制备载基因磁性白蛋白纳米球: 按照质量比30:1-50:1称取聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4磁性纳米粒悬液与质粒survivin-siRNA,将两者混合后孵育30分钟以上，得到聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4/survivin-siRNA 复合物； 按照聚乙烯亚胺修饰的Fe304/survivin_siRNA复合物与牛血清白蛋白粉质量比1:5^3:5，将前者放入牛血清白蛋白溶液中，搅拌混匀，调节pH值至9;一边搅拌，一边将乙醇缓慢滴至上述混合溶液中，直至溶液呈凝胶状，得到纳米粒溶液； 按照牛血清白蛋白与25%戍二醒溶液质量体积比2mg/~4mg/,向所述纳米粒溶液中缓慢滴加25%戊二醛溶液，磁力搅拌12~24小时，使纳米粒交联固化，制得固化的载基因磁性白蛋白纳米球溶液； 将所述载基因磁性白蛋白纳米球溶液高速离心，倾去上清液，超声分散，洗涤3次以上，即得到载基因磁性白蛋白纳米球； 2)采用SPDP交联法进行鼠抗人EGFR单克隆抗体与载基因磁性白蛋白微球的偶联，具体步骤如下:取鼠抗人EGFR单克隆抗体，溶于0.0f0...
【专利技术属性】
技术研发人员：张东生，侯欣欣，张皓，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：
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