在发酵期间用于酶促生产醇酯的脂肪酶的原位表达制造技术

本文公开了在发酵期间通过提供醇生产微生物生产醇酯的方法，所述微生物还包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在发酵期间用于酶促生产醇酯的脂肪酶的原位表达
本专利技术涉及包括乙醇和丁醇的醇的发酵生产、以及采用原位产物移除方法的用于改善醇发酵的方法。
技术介绍
醇在工业和科学中具有多种用途。例如醇可用作饮料(即，乙醇)、燃料、试剂、溶剂、和防腐败剂。例如丁醇是一种醇，它是重要的工业化学品，具有多种用途，包括用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和风味剂工业中用作食品级的提取剂。因此，高度需求醇如丁醇以及不依赖不可再生资源的高效生产方法。利用微生物发酵生产醇是一种这样的生产方法，其利用来自可再生原料的底物。在丁醇生产中，具体地讲一些生产高产量丁醇的微生物也具有低的丁醇毒性阀值，使得当生产丁醇时需要从发酵罐中去除丁醇。因此，存在对开发用于以高产率生产丁醇(尽管生产丁醇的微生物在发酵培养基中有低的丁醇毒性阈值)的有效方法和体系的持续需求。原位产物移除(ISPR)(也被称为提取发酵)可用于从其生产的发酵容器中取出丁醇(或其它发酵的醇)，从而使微生物以高产率生产丁醇。本领域已经描述过的一种用于移除发酵性醇的ISPR方法是液-液提取(美国专利申请公布20090305370)。一般来讲，关于丁醇发酵，例如，所述发酵培养基与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。丁醇被分配至有机提取剂相，降低了在与微生物接触的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。液-液提取由以下步骤引起:接触提取剂和发酵液体培养基以将产物醇传递到提取剂中；分离提取剂相与水相；以及优选地，再循环利用提取剂，同时在长期运行期间最小化提取剂分配系数的降低。 每一个循环 ，提取剂可随着时间进行而被污染，例如通过作为可水解的淀粉的原料被进料至发酵容器中的生物质中存在的脂质的积累。例如，在葡萄糖转化为丁醇的过程中加载至发酵容器的液化玉米醪可产生包含玉米油的发酵液体培养基，其通过同时的糖化和发酵产生(所述液化的醪的糖化在发酵过程中通过用于产生葡萄糖的葡糖淀粉酶的添加而发生)。在ISPR过程中，玉米油脂质溶解于提取剂中可导致脂质浓度随着每次提取剂的循环利用而积累，这使得产物醇在提取剂中的分配系数降低，因为提取剂中的脂质浓度随着每次循环利用而升高。将液化醪中存在的脂质转化成可在ISPR中使用的提取剂是一种减少进料于发酵容器中的脂质量的方法，它通过向发酵加入作为酯化作用催化剂的脂肪酶，用脂肪酸酯化在发酵期间产生的产物醇。此类方法在例如美国申请公布20110312044和20110312043，以及PCT申请公布W02011 / 159998中有描述，上述文献以引用方式并入本文。一直需要可供选择的提取发酵方法，其也能够减少与向发酵加入脂肪酶相关联的成本。
技术实现思路
本文提供的方法包括:a)提供发酵培养基，其包含来源于生物质原料的可发酵碳底物、产自来源于生物质原料的可发酵碳底物的醇、和醇生产微生物，其中醇生产微生物包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸，并且该微生物表达并展示或分泌所述多肽，使得发酵培养基中存在脂肪酶活性山)使发酵培养基与羧酸接触；其中脂肪酶活性以在细胞外将由微生物产生的醇的至少一部分转化成醇酯的足够量存在于发酵培养基中。在实施例中，醇生产微生物是酵母。在实施例中，编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸是经工程化的。在实施例中，该方法还包括使发酵培养基与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物。在实施例中，提取剂包括所述羧酸。在实施例中，产物醇是C2-C8烷基醇。在实施例中，产物醇是乙醇。在实施例中，醇酯包括脂肪酸乙酯。在实施例中，产物醇是丁醇。在实施例中，醇酯包括脂肪酸丁酯。在实施例中，醇酯还包括脂肪酸乙酯。在实施例中，本文提供的具有脂肪酶活性的多肽展示在微生物表面上。在实施例中，分泌出具有脂肪酶活性的多肽。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸包含与具有 SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271 或 273的多核苷酸具有至少约70%同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与具有 SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274的多肽或它们的活性片段具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。在实施例中，羧酸包括游离脂肪酸，所述游离脂肪酸来源于玉米油、低芥酸菜子油、棕榈油、亚麻籽油、麻风树油、或大豆油。在实施例中，羧酸来源于与可发酵碳底物相同的生物质原料。在实施例中，羧酸包括具有C12-C22直链或支化的脂肪链的羧酸。在实施例中，与提取剂的接触和与羧酸的接触同时发生。在实施例中，至少约60%有效滴度的由微生物产生的醇被转化成醇酯。在实施例中，发酵培养基还包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合，并且脂肪酶活性甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分水解以形成游离脂肪酸。在实施例中，在发酵期间产生的醇的有效滴度大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效滴度，并且该微生物表达并分泌或展示所述多肽,使得发酵培养基中存在该脂肪酶活性。在实施例中，在发酵期间产生的醇的有效速率大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效速率，并且该微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得发酵培养基中存在该脂肪酶活性。本文也提供了重组宿主细胞，其包含工程化的醇生产途径；和工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID N0:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或 274 或它们的活性片段具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID N0:249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个 具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。在实施例中，具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。在实施例中，编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸包含与 SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271 或 273具有至少约70%同一性，至少约80%同一性，至少约90%同一性，或至少约95%同一性的序列。本文也提供了重组宿主细胞，其包含醇生产途径；和工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽，其中该具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】
方法，包括：提供发酵培养基，所述发酵培养基包含来源于生物质原料的可发酵碳底物、产自来源于生物质原料的可发酵碳底物的醇和醇生产酵母微生物，其中所述醇生产微生物包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表达并展示或分泌所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性；使所述发酵培养基与羧酸接触；其中所述脂肪酶活性以在细胞外将由所述微生物产生的醇的至少一部分转化成醇酯的足够量存在于所述发酵培养基中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.17 US 61/498292;2012.03.23 US 13/4279871.方法，包括: 提供发酵培养基，所述发酵培养基包含来源于生物质原料的可发酵碳底物、产自来源于生物质原料的可发酵碳底物的醇和醇生产酵母微生物，其中所述醇生产微生物包含编码具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表达并展示或分泌所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性； 使所述发酵培养基与羧酸接触； 其中所述脂肪酶活性以在细胞外将由所述微生物产生的醇的至少一部分转化成醇酯的足够量存在于所述发酵培养基中。2.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述发酵培养基与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取剂包括所述羧酸。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物醇是C2-C8烷基醇。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物醇是乙醇。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸乙酯。7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述产物醇是丁醇。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸丁酯。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述醇酯还包括脂肪酸乙酯。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽在所述酵母微生物的表面上展示。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQID NO:249、250、251、252、253或它们的片段中的任何一个具有至少约70%同一性的序列。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸包含与具有 SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271 或 273 的多核苷酸具有至少约70%同一性的序列。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与具有 SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274的多肽或它们的活性片段具有至少约70%同一性的序列。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽是没有糖基化的。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸包括游离脂肪酸，所述游离脂肪酸来源于玉米油、低芥酸菜子油、棕榈油、亚麻籽油、麻风树油、或大豆油。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸来源于与所述可发酵碳底物相同的生物质原料。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸包括具有C12-C22直链或支化的脂肪链的羧酸。19.根据权利要求2—18中任一项所述的方法，其中所述与提取剂的接触和所述与羧酸的接触同时发生。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少约60%有效滴度的由所述微生物产生的醇被转化成醇酯。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还包含甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合，并且其中所述脂肪酶活性使所述甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂、或它们的组合的至少一部分水解以形成游离脂肪酸。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述在发酵期间产生的醇的有效滴度大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间产生的醇的有效滴度，并且所述微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述在发酵期间产生的醇的有效速率大于由不包含编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生产微生物在发酵期间醇产生的速率，并且所述微生物表达并分泌或展示所述多肽，使得所述发酵培养基中存在所述脂肪酶活性。24.重组宿主细胞，包含: 工程化的醇生产途径；和 工程化的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽。25.根据权利要求24所述的重组宿主细胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、256...

【专利技术属性】
技术研发人员：R迪科斯莫，AL克鲁科伯格，TE范阿肯，
申请(专利权)人：布特马斯先进生物燃料有限责任公司，
类型：
国别省市：