本发明专利技术公开了一种凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因及其编码蛋白。所述的凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其编码的钠钙交换子LvNCX蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明专利技术首次从凡纳滨对虾中克隆出钠钙交换子LvNCX基因，并通过实验证明该基因能够维持细胞体内钠、钙离子的平衡，为进一步深入分析NCX影响下生物抗逆能力，为NCX基因在凡纳滨对虾抗逆研究中的应用打下理论基础。
【技术实现步骤摘要】
凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因及其编码蛋白
本专利技术属于基因工程
，具体涉及凡纳滨对虾钠钙交换子LvVCX基因及其编码蛋白。
技术介绍
钠钙交换子(Sodium/calcium exchanger, NCX),为维持细胞体内钠、钙离子的平衡方面起着重要的作用，其是一种可逆膜转运蛋白，NCX在细胞膜或者细胞器的膜上都有发现，其功能是将2个Na+移出细胞，I个钙离子带入细胞，也可以以相反方向进行。NCX的功能是钙离子排出，以4:1:1 (Na+/Ga2+/K+)之比例排出，故为Na+/K+依存，是保持细胞内离子稳定的一类重要通道。 凡纳滨对虫下(Litopenaeus vannamei),又称白脚对虫下、万氏对虫下、太平洋白虫下，英文俗称Pacific White Shrimp (太平洋白虫下)(McGraw et al.，2002),我国俗称“南美白对虾”。该对虾原产于西半球，主要分布于中南美洲从墨西哥西南沿海，经危地马拉、萨尔瓦多、洪都拉斯、尼加拉瓜、哥斯达黎加、巴拿马、哥伦比亚、厄瓜多尔至秘鲁西部的太平洋沿岸。由于凡纳滨对虾具有繁殖期长；广盐性；广温性；可以密养产量高；抗病力较强；耐干性较强；肉质鲜美；个体较大等优点目前已经成为是全世界产量最大的养殖对虾，也是我国对虾养殖的主导品种。在我国，养殖区域遍布于全国沿海的海水养殖区和内陆的淡水养殖区，养殖面积约25万公顷，年产量超过100万吨，海水养殖区和淡水养殖区产量各约占50%，从2001年以来，我国养殖凡纳滨对虾面积和产量一直居于对虾养殖的首位。2009年凡纳滨对虾养殖产量约110万吨，占对虾总产量的87%，其中广东养殖产量超过四十万吨，所占比例接近40%。2010年我国虾类产品的生产总量126万吨，虾类出口 21.6万吨，出口值近11.4亿美元，年产值300~400亿元人民币，是我国水产养殖的支柱性产业。我国凡纳滨对虾养殖每年的种苗需求量超过5000亿尾。凡纳滨对虾在高低盐环境中都可以养殖，这与该对虾体内存在很强的盐度调节机制以适应外界环境盐度的变化是分不开的。钠钙交换子作为重要的离子通道基因在凡纳滨对虾遗传育种研究中应用潜力很大，然而凡纳滨对虾的NCX基因筛选报道较少，且NCX基因的鉴定、表达分析及聚类情况研究至今未有报道。
技术实现思路
本专利技术第一个目的是提供一种凡纳滨对虾钠钙交换子LvVCX基因及其编码蛋白。本专利技术的凡纳滨对虾钠钙交换子LvVCX基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其编码的凡纳滨对虾钠钙交换子蛋白LvVCX的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本专利技术的保护范围内。凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因的分离过程包括以下步骤:1、构建凡纳滨对虾抗低盐胁迫抑制缩减杂交文库；2、经过NCBI数据库分析，筛选到LvNCX基因的部分序列；3、逐级设计3’和5’ RACE (快速扩增cDNA末端)引物；4、提取凡纳滨对虾腮组织的RNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，采用步骤3中的引物进行PCR扩增出LvNCX基因的3’和5’序列，采用琼脂糖凝胶电泳回收片段，连接于pMD18-T载体上，测序分析之后利用DNAStar软件对序列进行拼接,其序列如SEQ IDN0.1所示，将此序列命名为凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因，其编码蛋白具有861个氨基酸残基，其序列如SEQ ID N0.2所示，将该蛋白命名为凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX蛋白。将 LvNCX 基因编码的蛋白质在 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中米用 Blastx 程序进行序列比对之后，发现该蛋白和Nasonia vitripennis的钠钙交换子序列有72%的同源性(如图1所示)，说明LvNCX基因所编码的蛋白具有钠钙交换子的结构特征。经Blastx比对，LvNCX基因所编码的蛋白序列不与任何先前已公布的蛋白序列完全一致，说明其是一个新发现的蛋白序列。提取凡纳滨对虾在高盐胁迫和低盐胁迫下的鳃、消化腺、肝胰腺、上皮组织及肌肉组织，利用实时定量荧光PCR技术分析LvNCX基因在不同组织的表达情况，研究结果表明凡纳滨对虾的各个组织在低盐度胁迫表达量都明显高于对照组，然后在高盐度胁迫中的上皮组织的表达量稍低。与此同时高盐度胁迫下，LvNCX在肝胰腺组织和肌肉组织中明显高于低盐度胁迫下的表达；反之鳃组织和消化腺组织中LvNCX表达量在低盐度胁迫下明显高于高盐度胁迫的表达；利用生物学软件做LvNCX基因的系统进化树，结果表明LvNCX基因是凡纳滨对虾的钠钙交换子基因。本专利技术首次从凡纳滨对虾中克隆出凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因，为进一步深入分析NCX影响下生物抗逆能力，为NCX基因在凡纳滨对虾抗逆研究中的应用打下理论基础。本专利技术通过对N CX基因cDNA表达调控规律的研究进一步验证LvNCX基因在盐度胁迫下的作用机理，提供了下一步探索和提高凡纳滨对虾抗逆选育的分子标记。同时还可以利用LvNCX基因的表达情况来有针对性的对凡纳滨对虾的抗逆选育提供理论指导。【附图说明】图1是LvNCX基因编码的蛋白的Blastx对比结果图；图2是凡纳滨对虾腮组织RNA电泳图，其中M为DL2000的Marker，I为凡纳滨对虫下腿组织RNA ；图3是首次3’ RACE结果，其中M为DL2000的Marker，I为3’ RACE产物；图4是首次5’ RACE结果，其中M为DL2000的Marker，I为5’ RACE产物；图5是重组载体pMD18-LvNCX5’ RACE转化大肠杆菌后的菌落PCR检测电泳图，其中M为DL2000的Marker, I~24为阳性菌落PCR扩增产物；图6 是第二轮 3 ‘RACE 结果，其中 M 为 DL2000DNA 的 Marker，I 为 3’ RACE PCR 产物I用M3-3和UPM引物扩增结果，2为3，RACE PCR产物2用M3-4和UPM引物扩增结果，3为3，RACE PCR产物3用M3-5和UPM引物扩增结果；图1 是第二轮 5 ‘RACE 结果，其中 M 为 DL2000 的 Marker，I 为 5’ RACE PCR 产物；图8是LvNCX基因的组织特异表达分析步骤中RNA提取结果，其中M为DL2000DNA的Marker，I~5分别为凡纳滨对虾鳃组织、消化腺组织，肝胰腺组织、上皮组织和肌肉的RNA。图9是LvNCX基因的组织特异表达分析步骤中cDNA合成结果，其中M为DL2000DNA的Marker，I~5分别为凡纳滨对虾鳃组织、消化腺组织，肝胰腺组织、上皮组织和肌肉的cDNA。 图10是LvNCX基因的组织表达特异性表达结果；图11是LvNCX蛋白的进化树分析；图12是LvNCX的全长cDNA扩增结果，M为DL15000，I为全长cDNA扩增结果。图13是原核重组表达载体pET-32a_LvNCX诱导表达的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白Marker，I为未经IPTG诱导的原核表达载体pET_32a，2为IPTG诱导2.5小时的原核重组表达载体pET-32a-LvNCX本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种凡纳滨对虾钠钙交换子LvNCX基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.一种由权利要求1所述的凡纳...
【专利技术属性】
技术研发人员：王艳红，任春华，胡超群，张吕平，罗鹏，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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