本发明专利技术涉及一种修饰草酸脱羧酶的方法，属于生物化工技术领域，具体来讲涉及一种单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的方法，包括重组草酸脱羧酶的制备、单甲氧基聚乙二醇（mPEG）的活化、草酸脱羧酶的修饰等工艺。经修饰后，草酸脱羧酶的热稳定性、pH适应性、耐热性及对胰蛋白酶的耐受性都有所增强。解决了目前草酸脱羧酶使用中存在受胃酸，蛋白酶消化的影响，容易被消化而失去其活性的现实问题。可用于制备预防和治疗草酸盐结晶引起结石病的酶制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工
，具体来讲涉及，包括重组草酸脱羧酶的制备、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的活化、草酸脱羧酶的修饰等工艺。
技术介绍
草酸以草酸盐的形式广泛的分布在植物、微生物和人在内的生物体内。人体内没有降解草酸盐的相关酶，人们在食用某些高草酸含量的食物如菠菜，苋菜，草莓，橘子，李子，花生酱，高粱和茶叶等会容易造成草酸盐在人体内积累，从而引发如尿结石、肾结石、高草酸尿、低血钙症等多种病理状态。董婷婷等在2011年《中国微生态学》杂志的《利用乳酸菌降解草酸预防结石的研究进展》文中提出泌尿性系统结石病严重影响着人类的健康，根据地理环境的不同其发病率在3%~15%，而且还呈上升到趋势，结石病治疗后易复发，治愈后复发率闻达60%~80%。Fredric L.Coe等对部分病人的结石成分进行分析,发现难溶的草酸钙高达80%，可见草酸盐是导致结石症的重要原因。目前对高草酸盐水平引起结石症的治疗方法都不是非常理想，主要通过限制草酸的摄入量来预防结石，而且许多原发性的高草酸尿患者需要密集的透析和器官移植，这大大增加了患者的痛苦和经济压力，因此需要寻求一种安全的从体内去除草酸盐的方法。通过服用某种酶制剂降解摄入体内的草酸盐，是缓解泌尿性系统草酸盐结石病症，降低患者痛苦的有效方法。 草酸脱羧酶(EC 4.1.1.2)催化转化草酸为甲酸和CO2,是生物体内催化降解草酸及草酸盐的主要催化酶之一，对底物草酸具有较强的专一性。草酸脱羧酶主要存在于木材腐败真菌中，如漆斑菌(Myrothecium Verrucari)、金针燕(Flammulina velutipes)、黑曲霉(Aspergillus niger)、双抱蘑燕(Agaricus bisporus)等,细菌中枯草杆菌(Bacillussubtilis)的草酸脱羧酶研究报道较多。草酸脱羧酶在医疗、食品、工业生产和生物监测等领域都有非常大的应用潜力。针对草酸盐结晶引起的结石症，目前已有一些使用草酸脱羧酶进行预防与治疗的研究报道。Patrick ff.Mufarrij利用体外实验设置不同pH以模拟消化道环境，研究了草酸脱羧酶制剂Oxazyme对菠菜中草酸的降解能力。Grujic D等使用基因敲除小鼠为模型，通过口服交联草酸脱羧酶晶体(OxDc-CLEC)，使尿草酸及粪草酸分别降低44%和72%。研究表明，使用草酸脱羧酶可以有效的降解动物消化道中草酸，对防止了肾钙质沉着症及尿石症的发生具有良好效果。然而，酶作为一种蛋白质，也存在容易受环境因素作用而变性失活的问题。草酸脱羧酶用于消化道内草酸降解时，将经受胃酸，蛋白酶消化的影响，容易被消化而失去其活性。为了改善草酸脱羧酶的使用性能，对其进行化学修饰是一种有效手段。
技术实现思路
在上述背景下，本专利技术提供一种可以解决目前草酸脱羧酶使用中受胃酸，蛋白酶消化的影响，容易被消化而失去其活性的现实问题，具体提供了一种单甲氧基聚乙二醇修饰改善草酸脱羧酶性能的方法。经修饰后，草酸脱羧酶的热稳定性、PH适应性、耐热性及对胰蛋白酶的耐受性都有所增强。可用于制备预防和治疗草酸盐结晶引起结石病的酶制剂。本专利技术采用如下技术制取本专利技术的技术方案:一种单甲氧基聚乙二醇修饰改善草酸脱羧酶性能的方法。包括重组草酸脱羧酶的制备，单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的制备两部分。工艺步骤如下: (1)重组草酸脱羧酶的制备 将产草酸脱羧酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK进行发酵培养。当细菌生长至0D600为0.8时，加入MnCl2及IPTG诱导草酸脱羧酶表达，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液重悬菌体后进行超声破碎细菌，离心收集上清为粗酶液。使用AKTA-FPLC系统进行酶纯化。粗酶液过0.2 μ m孔径膜后上柱(5 mL HisTraPHP离子交换色谱柱)，调节洗脱液中咪唑浓度进行洗脱，将草酸脱羧酶与其他杂质分离。分级分离酶液经超滤浓缩、脱盐，获得纯化的草酸脱羧酶。(2)单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的制备 称取适量mPEG5000溶解于少量氯仿，按醋酸酐/mPEG —定摩尔比加入醋酸酐，并加入适量经干燥处理后的二甲基亚砜(DMS0)，室温下搅拌反应3~12h后，将反应溶液逐滴加入4倍体积的冰乙醚，高速搅拌。过滤收集沉淀并用氯仿重溶，使用冰乙醚再次沉淀，重复2~3次，以去除产物mPEG醛中的杂质。将沉淀于室温真空干燥24h，去除残留有机溶剂和水分，即可获得活化的 单甲氧基聚乙二醇(单甲氧基聚乙二醇-醛)。mPEG醛化率的测定根据Schiff试剂能与醛发生显色反应，在560nm处有特征光吸收，测定560nm处测定吸光度值，制得吸光度值与戊二醛浓度的标准曲线，根据标准曲线可计算得到产品的醛化率。将mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按10:1~150:1的摩尔比例置于4~45°C和pH4~9条件下搅拌反应2-24h，加入过量甘氨酸终止反应。将反应产物装入8000-14000的透析袋，先使用磷酸盐缓冲液透析除去甘氨酸、残余单甲氧基聚乙二醇等杂质，然后使用30%(w/V)的PEG20000溶液浓缩处理。 修饰率的测定:采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定，根据TNBS与蛋白质分子上的游离氨基发生显色反应，在420nm处有特征光吸收。取ImL待测蛋白溶液(0-lmg/mL)，加入 ImL 4% NaHC03 (pH 8.5), ImL 10% SDS,静置 20min 后添加 ImL 0.1% TNBS 并将混合溶液置于40 V水浴2h。反应完成后取出反应液在420nm波长下测定吸收值,修饰前原酶蛋白的光吸收值记为A0，修饰酶的光吸收值记为Al，按下式计算修饰率:MR=1- (A1*C0)/(A0*C1)。其中C0、C1分别为修饰反应前后酶浓度及修饰反应后经透析浓缩所得酶的浓度。草酸脱羧酶的活力检测:反应液含76mmol/L草酸钾,50mmol/L pH 4.0柠檬酸缓冲液，37°C水浴2min，加入草酸脱羧酶液开始反应，IOmin后加入等体积的0.2mol/L磷酸氢二钾使体系PH上升至中性终止反应。终止反应液体系加入辅酶NAD+以及甲酸脱氢酶，分光光度法340nm检测分析甲酸脱羧酶催化反应速度，计算甲酸的生成量。酶活力单位定义为:每分钟催化转化草酸产生I μ mo I甲酸的酶量。 本专利技术的优点:本专利技术采用活化mPEG5000-醛和Oxdc直接进行修饰反应，条件温和、操作简单、成本较低；经修饰后，草酸脱羧酶的热稳定性、耐热性、PH适应性及对胰蛋白酶的耐受性都有所增强。【附图说明】图1a为实施例1中草酸脱羧酶修饰前后的热稳定性，图中为将修饰酶与游离酶分别置于65°C水浴，每隔半小时测酶活所得结果。图1 b为实施例1中草酸脱羧酶修饰前后的耐热性，图中为分别在45、50、55、60、65、70、75°C条件下处理游离及修饰的草酸脱羧酶30min，检测残余酶活所得结果。图2为实施例1中草酸脱羧酶修饰前后对胰蛋白酶的耐受性。图3为实施例1中草酸脱羧酶修饰前后的pH适应性，图中为分别测定修饰前和修饰后的草酸脱羧酶在PH为2、2.5、3、3.5、4、5、6、7时柠檬酸缓冲溶液体系下的酶活所得结果O【具体实施方式】下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的制备方法，其特征在于：?包括如下步骤：（1）单甲氧基聚乙二醇的活化：将mPEG5000溶解于氯仿，加入醋酸酐，并加入经干燥处理后的二甲基亚砜（DMSO），室温下搅拌反应3～12h后，将反应溶液逐滴加入4倍体积的冰乙醚，高速搅拌，过滤收集沉淀并用氯仿重溶，使用冰乙醚再次沉淀，重复2～3次，将沉淀于室温真空干燥24h，即可获得活化的单甲氧基聚乙二醇,即mPEG?醛；（2）修饰重组草酸脱羧酶：将mPEG5000?醛和Oxdc酶蛋白按10:1～150:1的摩尔比置于4～45℃和pH4～9条件下搅拌反应2?24h，加入过量甘氨酸终止反应，将反应产物装入8000?14000的透析袋，先使用磷酸盐缓冲液透析除去甘氨酸、残余单甲氧基聚乙二醇等杂质，然后进行浓缩处理。
【技术特征摘要】
1.一种单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)单甲氧基聚乙二醇的活化:将H1PEG5000溶解于氯仿，加入醋酸酐，并加入经干燥处理后的二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌反应3~12h后，将反应溶液逐滴加入4倍体积的冰乙醚，高速搅拌，过滤收集沉淀并用氯仿重溶，使用冰乙醚再次沉淀，重复2~3次，将沉淀于室温真空干燥24h，即可获得活化的单甲氧基聚乙二醇，即mPEG-醛； (2)修饰重组草酸脱羧酶:将mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按10:1~150:1的摩尔比置于4~45°C和pH4~9条件下搅拌反应2_24h，加入过量甘氨酸终止反应，将反应产物装入8000-14000的透析袋，先使用磷酸盐缓冲液透析除去甘氨酸、残余单甲氧基聚乙二醇等杂质，然后进行浓缩处理。2.根据权利要求1所述的单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的制备方法，其特征在于:步骤(1)中加入的醋酸酐与mPEG摩尔比为10:1~30:1。3.根据权利要求1所述的单甲氧基聚乙二...
【专利技术属性】
技术研发人员：林日辉，韦成昱，黄文勤，
申请(专利权)人：南宁奕德环境科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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