高灵敏可抛式多组分化学发光成像免疫传感器制造技术

本发明专利技术涉及一种高灵敏可抛式多组分化学发光成像免疫传感器。利用丝网印刷技术，在硅烷化载玻片上构建4×12阵列，通过在阵列点上包被不同捕获抗体，构建可抛式多组分免疫传感阵列。通过在金纳米粒子表面同时固定生物素化的捕捉DNA和多重G-四链体序列重复的信号DNA，利用G-四链体信号DNA与血红素结合形成DNA酶，制备多层DNA酶功能化金纳米粒子探针。基于夹心免疫分析，在传感阵列上形成夹心免疫复合物，通过生物素-亲和素反应，多层DNA酶功能化的金纳米粒子探针标记至不同免疫复合物上。利用DNA酶的过氧化物酶特性，催化化学发光底物H2O2-鲁米诺间的反应，获得灵敏化学发光信号，实现多种蛋白质的高灵敏图像免疫分析。该免疫传感器具有设计简单、成本低、灵敏度高、通量高、重现性好等优点，具有一定的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
高灵敏可抛式多组分化学发光成像免疫传感器一、
本专利技术为一种高灵敏可抛式多组分化学发光成像免疫传感器，涉及多个样品中多种待测组分的同时免疫分析，通过构建可抛式多组分免疫传感阵列，设计新型多层DNA酶功能化金纳米粒子探针，进行化学发光信号放大，用于多种蛋白质的高灵敏图像免疫分析。二、
技术介绍
免疫分析作为一种高选择性和高灵敏度的分析方法，在环境监测、临床诊断、食品安全等领域得到了日益广泛的应用。根据免疫分析步骤的不同可分为异相免疫分析和均相免疫分析，后者因为能获得更高的灵敏度而被广泛应用。化学发光免疫分析将化学发光测定技术与免疫分析结合，具有设备简单、灵敏度高、分析速度快、线性范围宽、发射光强度测量无干扰等优点。在实际应用领域中，经常需要测定复杂样品中多种组分的含量，并且越来越需要高灵敏的分析方法来提高对低丰度组分的准确检测。在大多数的免疫检测方法中，选择将天然酶如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶负载到纳米粒子上实现信号放大，但天然酶常常因为微小的构象变化就影响它们的催化活性从而导致变质，此外天然酶的制备和纯化也十分耗时和昂贵。测定复杂体系中多种组分的含量，传统上多采用平行单组分分析法，但是该法所需时间长、试剂消耗多、且工作量大，并非理想的分析模式。在单个分析流程中同时或者类同时实现多种组分的检测则具有分析通量高、所需时间短、样品消耗少、分析成本低等突出优点。基于空间分辨模式的化学发光免疫传感模式近年来在多组分免疫分析领域得到了广泛的关注，此模式是在免疫反应器的不同区域固定不同待测组分相对应的免疫试剂，使不同组分的免疫反应在反应器的不同空间位置同时发生，然后以阵列检测器进行信号采集，实现多个组分的同时检测。近年来，蛋白质检测阵列的研究引起了非常大的关注，然而蛋白质阵列多采用光刻技术或点阵技术制备而成，价格相对昂贵；另外，由于化学发光检测信号不灵敏，蛋白质阵列常需配备灵敏的阵列检测仪。三、
技术实现思路
本专利技术的目的是:结合丝网印刷和化学包被技术，构建可抛式多组分免疫传感阵列，同时设计一种多层DNA酶功能化金纳米粒子探针进行化学发光信号放大，提出一种高灵敏可抛式多组分化学发光成像免疫传感器及相应的免疫分析方法。本专利技术提出的可抛式多组分化学发光成像免疫传感器如图1所示，由可抛式多组分免疫传感阵列(I)、多层DNA酶功能化金纳米粒子探针(2)和信号产生体系(3)构成。通过以下技术方案来制备:I)可抛式多组分免疫传感阵列是依据空间分辨模式，在载玻片上印上4X 12的硅烷化阵列，在每I行滴加I种一定量的捕获抗体，抗体的氨基与硅烷化载玻片上的环氧基共价结合，反应结束后冲洗，再滴加封闭液，封闭结束后冲洗，吹干，制得可捕获共4种目标抗原的阵列(图2);2)多层DNA酶功能化金纳米粒子探针是在金纳米粒子表面同时固定生物素化的捕捉DNA和多重G-四链体序列重复的信号DNA而制成，后者结合血红素形成DNA酶，如图3所示；3)信号产生体系是利用DNA酶的过氧化物酶特性催化化学发光底物H2O2-鲁米诺间的反应，产生灵敏化学发光信号。传感器的工作原理:I)在可抛式4X 12多组分免疫传感阵列的每个传感点表面滴加待检测样品，进行温育；冲洗后在每个传感点表面滴加相应的生物素化二抗，进行夹心免疫反应；2)冲洗后，在每个传感阵列表面滴加链霉亲和素进行温育，而后再冲洗，并滴加多层DNA酶功能化金纳米粒子探针，反应结束后冲洗；3)在传感阵列表面滴加化学发光底物，通过CXD进行化学发光图像检测；4)每个传感器的化学发光信号与其所对应的检测组分的浓度成正相关，因而可利用标准溶液获得工作曲线，求出样品中不同蛋白质(抗原)的浓度，实现多种样品中多种蛋白质的同时高灵敏图像免疫分析。上述的分析方法，封闭液为含5%牛血清白蛋白(BSA)的0.0lM磷酸盐缓冲液，PH7.4 ;冲洗液为含0.05%吐温-20的0.0lM磷酸盐缓冲液，pH7.4。本专利技术与现有技术相比，具有以下特点:本专利技术结合多组分化学发光图像免疫检测手段，设计多层DNA酶功能化的金纳米粒子探针进行化学发光信号放大，通过可抛式多组分免疫传感阵列，提出了一种高灵敏多组分化学发光图像免疫传感方法。相对于现有检测系统，具有以下特点:(I)传感器是以硅烷化载玻片为基底的可抛式多组分免疫传感阵列，制备简单、成本低廉，同时由于该阵列具有4X 12个阵列传感点，可同时进行48个样品的免疫分析，具有通量高、稳定性和重现性好的优点。(2)设计新颖表面负载有高比例DNA酶的纳米探针，结合DNA酶对H2O2-鲁米诺反应的催化作用，进行信号放大，提高检测灵敏度，使其更适于低丰度蛋白质的检测。(3)设计的纳米探针表面富有生物素，基于生物素-亲和素反应，可作为四种蛋白质夹心免疫反应的共同信标探针。(4)该检测系统通过化学发光信号进行检测，不需要外加光源，设备及操作都非常简单。四、【附图说明】图1.高灵敏多组分化学发光图像免疫分析示意图图2.免疫传感器的制备及夹心免疫反应、信标结合反应及化学发光信号产生和采集示意图图3.多层DNA酶功能化的金纳米粒子探针的制备示意图五、【具体实施方式】实施例1:结合附图3，多层DNA酶功能化的金纳米粒子探针的制备合成13nm粒径的金纳米粒子，将两种5’端修饰巯基的DNA单链(包括:含有多重G-四链体序列重复的信号DNA单链，和3’端修饰生物素的捕捉DNA单链)按照一定的比例，通过金-巯键负载到金纳米粒子上。具体合成细节如下:在ImL 13nm粒径的金纳米粒子溶液中加入40 μ L I μ M生物素化捕捉DNA单链和24 μ L 100 μ M信号DNA单链，捕捉DNA和信号DNA的比例为1: 60，室温下搅拌16小时。然后，在上述反应溶液中逐滴加入含有2Μ NaCl的0.0lM PBS溶液，使NaCl在反应溶液中的最终浓度达到0.1Μ。随后，在上述反应溶液中加入0.1mL含有0.1M KCl的0.0lM PBS溶液，反应2小时。离心除去未结合的DNA单链，制备的DNA功能化金纳米粒子分布在含有0.1M KCl的0.0lM PBS中。最后，将上述制备的DNA功能化金纳米粒子与过量的血红素在4°C下反应1.5小时，离心除去未结合的血红素，制得多层DNA酶功能化金纳米粒子探针，分散在ImL 0.0lM PBS中，并保存在4°C条件下待用。实施例2:结合附图2，免疫传感器的制备及夹心免疫反应、探针结合反应及化学发光信号产生和采集过程在载玻片上丝网印刷4X12的硅烷化阵列，在每I行的每个阵列点表面滴加1.5 μ L —定浓度的捕捉抗体，使其在4°C 100%湿度条件下吸附过夜；抗体的氨基与硅烷化载玻片上的环氧基共价结合，反应结束后冲洗，晾干后在每个传感器表面滴加封闭液，封闭I小时后用冲洗液冲洗，晾干后，制得可捕获共4种目标抗原的阵列。在免疫传感阵列点表面滴加样品进行温育，结合待测抗原，然后冲洗液洗去样品并滴加生物素化抗体进行温育，形成夹心免疫复合物，洗去未结合的生物素化抗体，再滴加亲和素进行温育，生物素和亲和素结合后洗去未结合的亲和素，随后加入实施例1所制备的多层DNA酶功能化的金纳米粒子探针，继续温育。待纳米探针结合到夹心免疫复合物上后，洗去未结合的纳米探针，最后在免疫传感器表面滴加化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高灵敏可抛式多组分化学发光成像免疫传感器。其特征在于该传感器由可抛式多组分免疫传感阵列(1)、多层DNA酶功能化金纳米粒子探针(2)和信号产生体系(3)构成。其中(1)是在载玻片上印上4×12的硅烷化阵列，在每1行化学包被1种捕获抗体，制得可捕获共4种目标抗原的阵列；(2)是在金纳米粒子表面同时固定生物素化的捕捉DNA和结合血红素的多重G?四链体序列重复的信号DNA而制成；(3)是利用DNA酶的过氧化物酶特性催化化学发光底物H2O2?鲁米诺间的反应，产生灵敏化学发光信号，由数据采集系统(4)获得免疫传感图像信号。

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏可抛式多组分化学发光成像免疫传感器。其特征在于该传感器由可抛式多组分免疫传感阵列(I)、多层DNA酶功能化金纳米粒子探针(2)和信号产生体系(3)构成。其中(I)是在载玻片上印上4X12的硅烷化阵列，在每I行化学包被I种捕获抗体，制得可捕获共4种目标抗原的阵列；(2)是在金纳米粒子表面同时固定生物素化的捕捉DNA和结合血红素的多重G-四链体序列重复的信号DNA而制成；(3)是利用DNA酶的过氧化物酶特性催化化学发光底物H2O2-鲁米诺间的反应，产生灵敏化学发光信号，由数据采集系统(4)获得免疫传感图像信号。2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的可抛式多组分免疫传感阵列依据空间分辨模式，通过印上的4行硅烷化阵列，在载玻片上分别包被捕获抗体1-4而制得。3.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的多层DNA酶功能化金纳米粒子探针通过在金纳米粒子表面同时固定高比例多重G-四链体序列重复的信号DNA和生物素化的捕捉DNA，并利用G-四链体DNA与血红素结合形成DNA酶制成。4.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的多层DNA酶功能化金纳米...

【专利技术属性】
技术研发人员：严枫，宗晨，吴洁，鞠熀先，
申请(专利权)人：江苏省肿瘤医院，南京大学，
类型：发明
国别省市：