一种快速检测贝类毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测贝类毒素的方法，所述方法包括以下步骤：1)样品毒素的提取净化；2)毒素的鉴定；3)毒素-BSA偶联抗原制备；4)毒素单克隆抗体制备及纯化；5)免疫磁性微球的制备；6)制备葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；7)混合标记物的纯化；8)荧光免疫层析试纸条制备。所述方法特异性强、检测限低、并能实现抗原成分的定量检测。

【技术实现步骤摘要】
—种快速检测贝类毒素的方法
本专利技术涉及一种检测方法，具体涉及一种检测贝类毒素的方法。
技术介绍
贝类毒素属海洋天然有机物，它的形成与海洋中有毒藻类赤潮密切相关。有害赤潮已经成为世界性的问题，其发生的范围仍在不断扩大，能形成赤潮的有害藻类种类也在不断增加。据文献报道，能形成赤潮的微藻约有184267种，其中有毒微藻约为60?78种。有毒藻类产生的毒素往往通过食物链进入贝类体内，因而通常称这些毒素为贝毒，人们食用带有贝毒的贝类而造成食物中毒。我国四大海域中贝类毒素污染状况非常严重。调查发现，各大海域均存在广泛的贝类毒素污染情况，南北沿海均普遍存在。浙江省、中国台湾及广东省大亚湾均发生因食用染毒贝类而引起的多人中毒或死亡事件。另一方面，贝毒污染的严重性和地域的广泛性已严重影响到相关水产品的出口贸易。由于出口到欧盟的贝类多次被检出含有麻痹性贝类毒素，而我方未能提供官方贝类卫生监控计划。因此，欧盟从1997年7月I日起禁止我国贝类海产品进入欧盟市场。为尽快恢复对欧盟的贝类出口，参照国外情况，我国有关部门于1997年11月建立了贝类生产环境卫生监督管理的相关规定，对供出口贝类加工厂做原料的或直接上市的活贝类提出了卫生标准。但由于各国毒素分布状况有一定差异，我国沿海贝类毒素分布情况并不十分清楚，因此卫生标准难以反映毒素实际存在情况；再加上没有建立相应的监督管理机构和完善的贝类监测、检测手段及标准毒素。所以贝类水产品的质量改观不大。在2000-86-EC决议中，贝类仍被列为“不满意”和需进一步努力的产品行列。贝类毒素是由海洋中的有毒藻类通过食物链传递给藻食性的贝类，并在其体内蓄积、放大、转化形成的有毒高分子化合物，食用含有贝类毒素的贝类可能导致食源性疾病，根据中毒症状及机制的不同，贝类毒素主要分为4类:即腹泻性贝类毒素(diarrheticshellfish poisoning, DSP)麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning, PSP)遗忘性贝类毒素(amnesic shellfish poisoning, ASP)及神经性贝类毒素(neurotoxicshellfish poisoning，NSP)。据统计，全球由藻毒素引起的中毒事件中，87%是由麻痹性贝类毒素引起的，而第二位的腹泻性贝类毒素也占5%的比例，我国海洋赤潮毒素中最常见的也是麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素。国际上普遍接受的麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素的最大限量分别为80ug/100g贝肉以及20ug/100g贝肉。目前贝类毒素的检测方法主要有:小鼠生物法、高效液相色谱法以及一些免疫化学方法。小鼠生物法简便易行，适合于大规模、批量样品的检测，但不能区别毒素的种类和结构，干扰大、不精确。高效液相色谱法(HPLC)，特别是液-质联用技术，虽然可准确分析毒素的含量和种类，检出限可低至ng/g，但样品前处理繁琐费时，且仪器昂贵。只有一些大型实验室才具备此仪器，因此，适于现场监测和大量样本快速筛查。免疫化学方法是基于抗体对抗原的特异性结合的一种分析方法，因此具有特异性强，仪器设备简单，方法易掌握，样品前处理相对简单等优点。常见的利用免疫学方法进行毒素检测主要有酶联免疫吸附试验法(ELISA)和金标免疫试纸条。但酶联免疫吸附试验法涉及加样、温浴、洗涤、显色、终止等多个步骤，至少需要3小时，另外酶联免疫吸附试验法灵敏度只能达到10ng/ml，如果要对10ng/ml以下的物质进行检测，就会产生假阴性的结果，即漏检。这也是现在使用这种方法检测毒素的最大困扰之一。免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物的一种免疫技术。相比之下，胶体金技术的敏感性比酶联免疫吸附试验法更差，只能达到50ng/ml，要对海产品中生物毒素的微量检测几乎是不可能的，另外目前国内胶体金技术尚属于起步阶段，基本上不能对毒素检测进行定量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种能快速、准确检测贝类毒素的方法，所述方法特异性强、检测限低、并能实现抗原成分的定量检测。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。，包括以下具体步骤:1、毒素的提取净化1.1 提取称取试样，置于洁净的离心管中，加入80% (体积)甲醇水溶液，优选所述试样与所述甲醇水溶液的质量体积比为2g:10mL。超声提取5min后，6000r/min离心IOmin,重复提取一次。合并上层液，用80% (体积)甲醇水溶液定容得定容液，优选所述试样与所述定容液的质量体积比为2g:25mL。取二分之一的定容液于另一离心管中，加入正己烷，涡旋混匀，分层，弃去正己烷层，优选所述试样与所述正己烷的质量体积比为2g:5mL。加入水和三氯甲烷，涡旋混匀，分层，吸取水相于另一离心管中，优选所述试样与所述水和所述所述三氯甲烷的质量体积比分别为2g:lmL:6mL。用三氯甲烷重复萃取二次，合并三氯甲烷层，于60°C水浴氮气吹干仪中用氮气流吹至近干。残余物用20% (体积)正己烷丙酮溶液溶解，待净化。1.2 净化依次用:丙酮、甲醇和20% (体积)正己烷丙酮溶液活化固相萃取柱。注入提取液，然后分别用20% (体积)正己烷丙酮溶液和3% (体积)甲醇丙酮溶液淋洗，抽干。5min后，用40% (体积)甲醇丙酮溶液进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液于45°C水浴、氮气流中吹干。残余物用80 % (体积)甲醇水溶液溶解，混匀。2、毒素的鉴定通过HPLC和HPLC-MS分析，以标准化合物相对保留指数以及质谱碎片断裂规律鉴定关键组成并同时进行含量测定。3、毒素-BSA偶联抗原制备采用碳二亚胺法进行毒素与载体蛋白偶联。毒素-BSA完全抗原用于制备毒素单克隆抗体。每IOmg毒素溶于2.5ml无水乙醇,并与溶于Iml双蒸水的2.5mg盐酸经胺混合。在冰浴条件下反应2.5h，其间滴入0.05mol/L的NaOH溶液lml。反应后滴人0.2mol/L、pH4的醋酸盐缓冲液1ml，并加人碎冰约4m g，出现白色沉淀，在4°C下静置Id。将反应液离心(优选转速10000r/min, IOmin),弃去上清液。白色沉淀用2.5m I 二甲基甲酰胺溶解后,加人6m g琥珀酸酐,室温反应2h，加入三乙胺lOOiil，继续反应Ih。称取60mg BSA溶于IOml (约为酰化物体积的两倍)的PBS (0.01mol/L, pH5.0)溶液中，加人12.5mg水溶性碳二亚胺(EDC)。逐滴(10滴/min)滴加上面反应好的酰化产物。反应Ih后，再加6m g E DC,暗处搅拌反应并过夜。用双蒸水透析2d (透析袋用PBS处理24h)，期间换液4次。4、毒素单克隆抗体制备及纯化4.1、小鼠免疫及细胞融合取制备所得毒素完全抗原偶联物与弗氏完全佐剂等体积混合均匀。取0.3mL混合液(含100 y g毒素-BSA)皮下注射7周龄、重量20g左右的BALB/c小鼠。每隔2周用弗氏不完全佐剂与毒素-BSA混匀重复免疫，加强免疫7天。眼眶取血，用酶联免疫吸附测定间接法(ELISA, Enzyme-Linked ImmunosorbnentAssay)测定其效价。将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:1?10:1的比例混合，用PEG快速融八本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测贝类毒素的方法，包括以下具体步骤：1)、样品毒素的提取净化；2)、毒素的鉴定；3)、毒素?BSA偶联抗原制备采用碳二亚胺法进行毒素与载体蛋白偶联，毒素?BSA完全抗原用于制备毒素单克隆抗体；4)、毒素单克隆抗体制备及纯化；5)、免疫磁性微球的制备：5.1、水产品生物毒素单克隆抗体偶联生物素将活化好的生物素溶解于DMSO中，使其浓度为2.5mg/mL，分装后，置于?20℃保存；每2mL浓度为5mg/mL的毒素单克隆抗体，在0.1M?pH8.5的碳酸盐缓冲液中，透析过夜，第二天取出，备用；取透析好的毒素单克隆抗体1.6mL，约8mg，加1M?pH8.5碳酸盐缓冲液300uL，混匀后，再加生物素500uL，室温搅拌2h；加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，4℃搅拌0.5小时；离心，弃上清，取沉淀，用1×PBS溶解后，再加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50％，4℃搅拌0.5小时；弃上清，取沉淀，用3.0mL1×PBS溶解，在1×PBS中透析24h，终体积为4mL，PAGE及ELISA检测产物效价；5.2、磁性微球的制备把0.01g?Fe/C纳米磁粉分散于2ml壳聚糖水溶液中，并逐滴滴入溶解有表面活性剂AOT的甲苯溶液中，机械搅拌乳化；滴入25％戊二醛溶液，在2000r/min机械搅拌下反应1小时；反应后用乙醇、丙酮、蒸馏水反复洗涤洗去表面活性剂和有机溶剂，用磁分离架分离出磁性成分；使之分散在蒸馏水中4℃保存，取出其中1ml真空干燥48小时计算其中固体含量，调节微球浓度使最终浓度为1mg/ml，1ml的悬浮液含有微球约1×1010，由于戊二醛用作交联剂，磁性载体表面含有丰富的悬垂的醛基；5.3、磁性微球与链霉亲和素的连接在磁场作用下用pH6.0浓度为10mmol/L的NaH2PO4缓冲液洗涤1ml磁珠，在圆底小烧瓶中加入连接液，混匀，室温下摇床中震荡15min，避免磁珠沉淀，并起混匀作用，磁场下用缓冲液B：HCl2mmol/L洗涤，用缓冲液C：NaH2PO4或Na2HPO4，20mmol/L，pH7.5重悬磁珠，立即加入100uL链霉亲和素，重悬在PBS液中；连接有链霉亲和素的磁珠即可与偶联生物素的毒素单克隆抗体相结合；6)、制备葡聚糖?抗体?荧光素混合标记物；7)、混合标记物的纯化7.1葡萄球菌G蛋白亲和层析；7.2用Sephadex?G25凝胶柱纯化荧光素标记的单克隆抗体：将亲和层析后的葡聚糖?抗体?荧光素混合标记物过Sephadex?G25凝胶柱进行层析，葡聚糖?抗体?荧光素混合标记物会因为其大分子量而首先从纯化柱中洗脱出来，而相对分子量较小的单克隆抗体则在上述峰值之后才缓慢从纯化柱中洗脱出来；葡聚糖?抗体?荧光素混合标记物经透析后存放于缓冲液中，缓冲液配方为：0.5％(重量)BSA+3％(重量)海藻糖+0.1％(重量)Tween?20，10m?M?pH7.5Tris?HCL；8)、荧光免疫层析试纸条制备作用原理：采用双抗体夹心法原理定量检测样品中生物毒素；结果判断：用制备的试纸条检测样品中的生物毒素，每一种毒素检测试纸条上均有对照线C和检测线T，不同毒素检测判断的原则相同。...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测贝类毒素的方法，包括以下具体步骤: 1)、样品毒素的提取净化； 2)、毒素的鉴定； 3)、毒素-BSA偶联抗原制备 采用碳二亚胺法进行毒素与载体蛋白偶联，毒素-BSA完全抗原用于制备毒素单克隆抗体； 4)、毒素单克隆抗体制备及纯化； 5)、免疫磁性微球的制备: 、5.1、水产品生物毒素单克隆抗体偶联生物素 将活化好的生物素溶解于DMSO中，使其浓度为2.5mg/mL,分装后，置于_20°C保存；每2mL浓度为5mg/mL的毒素单克隆抗体，在0.1M pH8.5的碳酸盐缓冲液中，透析过夜，第二天取出，备用；取透析好的毒素单克隆抗体1.6mL，约8mg，加IM pH8.5碳酸盐缓冲液300uL，混匀后，再加生物素500uL，室温搅拌2h ;加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50%，4°C搅拌0.5小时；离心，弃上清，取沉淀，用I XPBS溶解后，再加入饱和硫酸铵，使硫酸铵饱和度为50%，41:搅拌0.5小时；弃上清，取沉淀，用3.0mLl XPBS溶解，在IXPBS中透析24h，终体积为4mL，PAGE及ELISA检测产物效价； 、5.2、磁性微球的制备 把0.01g Fe/C纳米磁粉分散于2ml壳聚糖水溶液中，并逐滴滴入溶解有表面活性剂AOT的甲苯溶液中，机械搅拌乳化；滴入25%戊二醛溶液，在2000r/min机械搅拌下反应I小时；反应后用乙醇、丙酮、蒸馏水反复洗涤洗去表面活性剂和有机溶剂，用磁分离架分离出磁性成分；使之分散在蒸馏水中4°C保存，取出其中Iml真空干燥48小时计算其中固体含量，调节微球浓度使最终浓度为lmg/ml，lml的悬浮液含有微球约I X 101(1，由于戊二醛用作交联剂，磁性载体表面含有丰富的悬垂的醛基； 、5.3、磁性微球与链霉亲和素的连接 在磁场作用下用PH6.0浓度为lOmmol/L的NaH2PO4缓冲液洗涤Iml磁珠，在圆底小烧瓶中加入连接液，混匀，室温下摇床中震荡15min,避免磁珠沉淀,并起混匀作用，磁场下用缓冲液B:HC12mmol/L洗涤，用缓冲液C =NaH2PO4或Na2HPO4, 20mmol/L, pH7.5重悬磁珠，立即加入IOOuL链霉亲和素，重悬在PBS液中；连接有链霉亲和素的磁珠即可与偶联生物素的毒素单克隆抗体相结合； 6)、制备葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物； 7)、混合标记物的纯化 、7.1葡萄球菌G蛋白亲和层析； 、7.2用SephadeX-G25凝胶柱纯化荧光素标记的单克隆抗体:将亲和层析后的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物过SephadeX-G25凝胶柱进行层析，葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物会因为其大分子量而首先从纯化柱中洗脱出来，而相对分子量较小的单克隆抗体则在上述峰值之后才缓慢从纯化柱中洗脱出来；葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物经透析后存放于缓冲液中，缓冲液配方为:0.5% (重量)BSA+3% (重量)海藻糖+0.1% (重量)Tween-20, IOm M pH7.5Tris-HCL ； 8)、荧光免疫层析试纸条制备作用原理:采用双抗体夹心法原理定量检测样品中生物毒素； 结果判断:用制备的试纸条检测样品中的生物毒素,每一种毒素检测试纸条上均有对照线C和检测线T，不同毒素检测判断的原则相同。2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤I)具体为: （ 1.1提取 称取试样，置于洁净的离心管中，加入80% (体积)甲醇水溶液，所述试样与所述甲醇水溶液的质量体积比为2g:10mL ;超声提取数次后，合并上层液，用80% (体积)甲醇水溶液定容得定容液；所述试样与所述定容液的质量体积比为2g:25mL ;取二分之一的定容液于另一离心管中，加入正己烷，涡旋混匀，分层，弃去正己烷层，所述试样与所述正己烷的质量体积比为2g:5mL;加入水和三氯甲烷，涡旋混匀，分层，吸取水相于另一离心管中，所述试样与所述水和所述所述三氯甲烷的质量体积比分别为2g:lmL:6mL ;用三氯甲烷重复萃取二次，合并三氯甲烷层，于60°C水浴氮气吹干仪中用氮气流吹至近干；残余物用20% (体积)正己烷丙酮溶液溶解，待净化； （1.2净化 依次用:丙酮、甲醇和20% (体积)正己烷丙酮溶液活化固相萃取柱；注入提取液,然后分别用20% (体积)正己烷丙酮溶液和3% (体积)甲醇丙酮溶液淋洗，抽干；5min后，用40% (体积)甲醇丙酮溶液进行洗脱，收集洗脱液；洗脱液于45°C水浴、氮气流中吹干；残余物用80% (体积)甲醇水溶液溶解，混匀。3.如权利要求2所述的方法，其中，步骤3)具体为: 每IOmg毒素溶于2.5ml无水乙醇,并与溶于Iml双蒸水的2.5mg盐酸经胺混合；在冰浴条件下反应2.5h，其间 滴入0.05mol/L的NaOH溶液1ml，反应后滴人0.2mol/L、pH4的醋酸盐缓冲液1ml，并加人碎冰约4m g，出现白色沉淀，在4°C下静置Id ;将反应液离心，弃去上清液；白色沉淀用2.5m I 二甲基甲酰胺溶解后，加人6m g琥珀酸酐，室温反应2h，加入三乙胺100 yl，继续反应I h;称取60mg BSA溶于IOml的PBS溶液中，加人12.5mg水溶性碳二亚胺；逐滴滴加上面反应好的酰化产物，反应Ih后，再加6m g E D C，暗处搅拌反应并过夜；用双蒸水透析2d，期间换液4次。4.如权利要求3所述的方法，其中，步骤4)具体为: （4.1、小鼠免疫及细胞融合 取制备所得毒素完全抗原偶联物与弗氏完全佐剂等体积混合均匀；取0.3mL混合液，含10...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军涛，陈守义，朱伟，
申请(专利权)人：广州市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：