一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌及其发酵工艺制造技术

本发明专利技术提供了一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌及其发酵工艺。本发明专利技术采用洋葱伯克霍尔德菌GJ(B.cenocepacia)为原始菌，通过荧光型启动子探针载体从其中筛选组成型强启动子Pcon，将不含启动子的T7RNA聚合酶基因克隆在启动子Pcon，经电转化将二者导入原始菌中获得宿主菌，再将脂肪酶基因克隆到通用载体pBBR22b中得脂肪酶表达质粒，经电转化将脂肪酶表达质粒导入宿主菌中获得脂肪酶工程菌BurkholderiacenocepaciaMTPF），CCTCC?NO:M2013229。本发明专利技术能大大提高脂肪酶的表达量，生产的脂肪酶有较好的催化活力，低碳醇耐受性以及耐高温性。

【技术实现步骤摘要】
一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌及其发酵工艺
本专利技术涉及基因工程技术和发酵优化领域，特别是涉及脂肪酶工程菌的构建方法，以及针对该工程菌的脂肪酶发酵工艺。
技术介绍
在能源危机越演越烈的今天，寻找高效、清洁的可再生能源是一项极为重要和迫切的任务，而利用废弃动、植物油脂转化生产生物柴油无疑是最有效、最直接的办法。目前生物柴油转化主要有化学法和酶法两种，其中化学法能耗高、污染大；酶法则具有反应条件温和、无污染等优点，是解决能源危机的有效途径。酶法制备生物柴油的工艺中，脂肪酶成本最高、容易失活等问题是制约工艺进一步发展的主要瓶颈，不同来源脂肪酶制备生物柴油的效率和得率也不同。Jaeger等人证明洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶在众多脂肪酶中能够催化的反应类型最多，反应活性和稳定性最高，对酸、碱、短链醇等物质的耐受性最高[参见Jaeger KE, Eggert T.Lipases forbiotechnology.Current Opinion in Biotechnology, 2002,13 (4):390-397]。本实验室也筛选到一株产脂肪酶的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholder本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌，其特征在于，它是洋葱伯克霍尔德菌MTPF(Burkholderia?cenocepacia?MTPF)，CCTCC?NO：M2013229。

【技术特征摘要】
1.一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌，其特征在于，它是洋葱伯克霍尔德菌MTPF (Burkholderia cenocepacia MTPF)，CCTCC NO:M2013229。2.一种洋葱伯克霍尔德菌MTPF组成型强启动子P_，具有下述之一的核酸序列: (1)序列表中序列I所述的核酸序列； (2)与序列为序列表之序列I中同源区域的同源性在80%以上的核酸序列； (3)在中度严谨条件下能与序列表中序列I的序列杂交的核酸序列。3.一种载体，含有权利要求2所述的洋葱伯克霍尔德菌MTPF组成型强启动子P_。4.一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌的构建方法，包括以下步骤: (1)将经BglII酶切的原始菌(Burkholderia cenocepacia GJ)基因组DNA片段连入启动子探针载体pPScreen的BamHI位点中，构建启动子文库，测定文库中所有克隆在激发光485nm，吸收光510nm的相对荧光强度和波长600nm的光吸收值，以相对荧光强度与0D_的比值作为判断标准，筛选出组成型强动子P_，该组成型强动子P_的核酸序列为序列表中序列I所述的核酸序列；或与序列为序列表之序列I中同源区域的同源性在80%以上的核酸序列；或在中度严谨条件下能与序列表中序列I的序列杂交的核酸序列； (2)先分别用引物对PRF/PRR扩增启动子P_，用引物对T7F/T7R扩增无启动子的T7RNA聚合酶基因，再用T7F和PRR作引物，前两个PCR反应的产物做模板，扩增出受Pcon调控的T7RNA聚合酶基因，然后将它们克隆到载体pUT/min1-Tn5Km的NotI位点中，最后再把甲氧苄啶抗性基因克隆到PstI位点中，构建出整合质粒pTnTpT7 ； (3)通过电转化将整合质粒ρΤηΤρ--导入原始菌,转化子在20_200ug/ml的甲氧节唳抗生素梯度平板上进行初筛，再将最高浓度平板上的转化子进行荧光定量PCR检测，选取其中T7RNA聚合酶基因拷 贝数最高的转化子做宿主菌； ...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫云君，贾彬，徐莉，张后今，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：