一种全基因组DNA甲基化的导向测序技术制造技术

本发明专利技术涉及一种全基因组DNA甲基化的导向测序技术。本发明专利技术提供了一种新的核酸甲基化的测定方法。具体地说提供了一种核酸甲基化检测的“定位”理念，即测序时部分序列用来定位，另一部分序列用于甲基化的检测，从而彻底解决了全基因组甲基化检测及生物信息学分析时遇到的定位问题。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种全基因组DNA甲基化的导向测序技术。本专利技术提供了一种新的核酸甲基化的测定方法。具体地说提供了一种核酸甲基化检测的“定位”理念，即测序时部分序列用来定位，另一部分序列用于甲基化的检测，从而彻底解决了全基因组甲基化检测及生物信息学分析时遇到的定位问题。【专利说明】—种全基因组DNA甲基化的导向测序技术
本专利技术属分子生物学-表观遗传学领域；更具体地，本专利技术涉及全基因组DNA甲基化的导向测序技术。
技术介绍
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，其在维持正常细胞功能、胚胎发育、疾病发生以及人类肿瘤中发挥着至关重要的作用。DNA甲基化的水平，尤其是基因启动子区甲基化的水平直接影响着基因的转录活性，控制着基因的表达，在生命过程中DNA甲基化扮演着重要的角色。因此DNA甲基化的研究在表观遗传学，甚至在整个生命科学领域都是研究的重中之重。DNA甲基化的检测方法很多，但根据其原理主要可以分为以下三类:1.基于甲基化敏感限制性内切酶的方法甲基化敏感的限制性内切酶(methylation-sensitiverestrictionendonucleases, MSREs)是一类对甲基化修饰敏感的内切酶。此类酶在其切割位点中含有一个甲基化碱基就可以阻断该内切酶对DNA的切割，再通过Southern Blot或者PCR来检测。这种方法中最常用的是HpaII和MspI这一对内切酶，HpaII和MspI识别序列相同但HpaII对甲基化敏感而MspI对甲基化不敏感，此法的优点是操作简单，缺点是因为受到内切酶酶切位点的限制，对于可研 究的甲基化区域受到很大的限制。2.基于DNA甲基化抗体的方法基于抗体的DNA甲基化研究方法是应用甲基胞嘧啶抗体或是甲基化结合蛋白的抗体来研究DNA甲基化。其原理和操作都类似于ChIP，即将抗体亲和的DNA片段进行芯片杂交或者测序。优点是可以在全基因组范围内研究DNA甲基化的变化情况，但此方法缺乏精确性，无法知道单个碱基的甲基化情况，而且该方法容易受到基因组中不同区域CG含量的影响，从而对于基因组中低CG含量的区域缺乏敏感性。3.基于亚硫酸氢钠的方法DNA甲基化的检测方法中应用最广的是基于亚硫酸氢钠的方法。其优点在于可以精确检测单碱基分辨率甲基化变化情况。这种方法的原理为DNA经过亚硫酸氢钠处理后未被甲基化修饰的C (胞嘧啶)可转变为U (尿嘧啶)，然而有甲基化修饰的C则不会发生改变，经过PCR扩增后测序，再与原序列对比就可以得到基因组中某段区域的甲基化修饰情况。近年来随着人们对DNA甲基化研究的深入，这些传统的方法已经远远不能满足研究的需要。随着高通量测序技术的发展，DNA甲基化检测也由单基因水平逐渐向整个基因组水平发展。这样基于以上三种方法与高通量技术相结合又衍生出了很多方法:如MeDIP, RRBS, HELP等，但其中应用最广，覆盖基因组最多、最精确的方法为MethylC-seq。其原理为基因组DNA经过亚硫酸氢钠处理后直接进行高通量测序，从理论上讲，对测序结果进行分析后就可以得到整个基因组单碱基分辨率的甲基化修饰情况。但是实际操作中对MethylC-seq的数据进行分析时却遇到了很大的问题:①由于亚硫酸氢钠处理后基因组中大多数的胞嘧啶(C)都会转变为胸腺嘧啶(T)，造成碱基不平衡，测序得到的结果比对(map)到参考基因组上效率有限，有的位置即使增大测序通量也无法得到DNA甲基化信息，所以到目前为止全世界还没有绘制出任何一张细胞完整甲基化图谱。Felix Krueger等人在 Nature Method (Nat Methods.2012Jan30 ；9(2): 145-51.)杂志上对于 DNA 甲基测序数据分析中遇到的问题进行了详细的论述。②该检测方法的设计策略缺陷也使其存在很强的倾向性，容易检测出高甲基化区域，对低甲基化、CG含量少以及一些重复序列缺乏敏感度。总体来说，到目前为止Methyic-seq是DNA甲基化研究比较好的方法，但是其本身的设计缺陷和检测偏好性以及生物信息学分析时遇到的问题却极大地阻碍了其应用。而本专利技术中所使用的定位理念可以彻底解决这些问题，把人们对DNA甲基化的研究提高到了一个新的高度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种全基因组DNA甲基化的导向测序技术。在本专利技术的第一方面，提供一种核酸甲基化的测定方法，所述的核酸是双链，所述方法包括:(I)针对核酸双链，利用具有3’ 一 5’方向切割功能的聚合酶或3’ 一 5’核酸外切酶处理，使两条链分别在3’端产生80-200个碱基(较佳地100-150个碱基)缺失；(2)加入dNTP，其中的胞嘧啶(C)为甲基化修饰的胞嘧啶(5mC)，使双链3’端的缺失被补平且其中的胞嘧啶为甲基化修饰的胞嘧啶；(3)处理步骤⑵的双链，使未被甲基化修饰的胞嘧啶转变为尿嘧啶(U)、甲基化修饰的胞嘧啶则不变；`(4) PCR扩增(该过程中尿嘧啶转换为胸腺嘧啶(T))，进行甲基化测序，其中一部分序列中未甲基化的胞嘧啶(C)已转变为胸腺嘧啶(T)，用于判断甲基化位点；另一部分序列因胞嘧啶发生甲基化而与原核酸序列相同，用于数据分析时的序列定位；将两部分序列比对(如果检测的物种序列已知则不需要拼接；未知序列的物种可以将用于定位的那一端进行拼接后再进行甲基化比对)，从而得知核酸的甲基化状况。在本专利技术的另一方面，所述的核酸甲基化的测定方法同样可用于单个基因位点的检测，其中步骤⑷包括:设计用于扩增感兴趣的基因位点的PCR扩增引物，一条引物定位于胞嘧啶发生甲基化的序列位置；另一引物定位于未甲基化的胞嘧啶已转变为胸腺嘧啶的序列位置，进行PCR扩增，得到感兴趣的基因位点的序列并进行甲基化分析。在一个优选例中，步骤(3)或步骤(b)中，应用重硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(2)的双链。在另一优选例中，所述的核酸是长度大于2kb(如大于3kb、5kb、10kb)的核酸或是全基因组，在步骤(1)之前，还包括:将核酸序列进行打断(较佳地，采用超声打断)，形成长度为200-1000bp (较佳地400-700bp ;更佳地500bp)的双链片段。在另一优选例中，步骤(2)中，在进行补平之后，还包括:在步骤(2)的双链的两端加上测序接头，从而应用于高通量测序。在另一优选例中，所述的测序接头如下连接:在双链的3’末端加上I个突出的A)，应用带有(3’末端含有一个突出的T)的测序接头与之连接；较佳地，所述的测序接头是甲基接头(Methyl Adapterjnillumina Methyl Adapter),后续采用高通量测序方法测序，例如 Illumina high seq2000, Illumina high seq2500> ABI solid、Roche454。在另一优选例中，所述的胞嘧啶的甲基化修饰包括:CpG甲基化，CHG甲基化或CHH甲基化。在另一优选例中，所述的具有3’ 一 5’方向切割功能的聚合酶包括(但不限于):T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，Klenow酶； 所述的3’ 一 5’核酸外切酶包括(但不限于):核酸外切酶III ;较佳地，当步骤(I)应用3’一 5’核酸外切酶时，步骤(2)中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸甲基化的测定方法，其特征在于，所述的核酸是双链，所述方法包括：(1)针对核酸双链，利用具有3’→5’方向切割功能的聚合酶或3’→5’核酸外切酶处理，使两条链分别在3’端产生80?200个碱基缺失；(2)加入dNTP，其中的胞嘧啶为甲基化修饰的胞嘧啶，使双链3’端的缺失被补平且其中的胞嘧啶为甲基化修饰的胞嘧啶；(3)处理步骤(2)的双链，使未被甲基化修饰的胞嘧啶转变为尿嘧啶、甲基化修饰的胞嘧啶则不变；(4)PCR扩增，进行甲基化测序，其中一部分序列中未甲基化的胞嘧啶已转变为胸腺嘧啶，用于判断甲基化位点；另一部分序列因胞嘧啶发生甲基化而与原核酸序列相同，用于数据分析时的序列定位；将两部分序列比对，从而得知核酸的甲基化状况。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于文强，李岩，吴飞珍，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：