一种用于检测欧美杨溃疡病菌的特异性引物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测欧美杨溃疡病菌的特异性引物，所述引物由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为：CTCTGCTAAATCGGGGACGG；反向引物的核苷酸序列为：CACGAGCTTTCTTCTCGTCC。本发明专利技术还提供了基于上述引物的试剂盒和采用上述引物检测欧美杨溃疡病病菌的方法。本发明专利技术准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品中是否存在欧美杨溃疡病菌，为欧美杨溃疡病田间调查，病害监测提供有效手段。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用于检测欧美杨溃疡病菌的特异性引物，所述引物由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为：CTCTGCTAAATCGGGGACGG；反向引物的核苷酸序列为：CACGAGCTTTCTTCTCGTCC。本专利技术还提供了基于上述引物的试剂盒和采用上述引物检测欧美杨溃疡病病菌的方法。本专利技术准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品中是否存在欧美杨溃疡病菌，为欧美杨溃疡病田间调查，病害监测提供有效手段。【专利说明】
本专利技术涉及植物病原菌检测领域，具体地，本专利技术涉及一种用于检测欧美杨溃疡病病菌的特异性引物、试剂盒和方法。
技术介绍
欧美杨溃瘍病病原菌经分析鉴定为Lonsdalea quercina subsp.populi,属于L.quercina的一个亚种,在我国是新记录种和亚种，而由它引起的欧美杨溃瘍病在我国是新的林木病害。目前该病菌仅在我国和匈牙利有报道，其它国家未见报道。该病害在我国河南、山东局部地区广泛栽培的欧美杨品种107杨和中林46杨上普遍发生，发病率一般为10~30%，病害严重的林分病株率达70%以上，感病树木产生大量伤流，损耗树木养分，使树木材积和其他可利用部分减少；同时，由于韧皮部局部坏死，造成病部枝干和顶梢枯死，严重影响树木的健康生长，甚至造成死亡。该病多出现在完全健康的欧美杨林分，无法根据先年病害发生情况对来年病害的发生作出判断。而病害一旦发生，又难以控制。因此，对病原菌进行早期检测，并采取相应措施防治病害发生，对于病害的控制至关重要。按常规方法从该病的病组织中分离病原菌常出现很多杂菌，影响病原菌的准确分离。同时，根据形态无法将该病菌与其他细菌区分开来。因此，常规的病害诊断技术难以快速准确地对该病害的病原菌作出鉴定。所以，建立欧美杨溃疡病病原菌的检测技术，尤其是早期快速检测技术尤为重要和迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于欧美杨溃瘍病菌Lonsdalea quercina subsp.populi PCR检测的特异性引物，采用该引物能对欧美杨溃疡病病原菌进行早期检测，检测特异性强、灵敏度高、易于操作`、结果可靠。为达到上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案:本专利技术通过分析欧美杨溃疡病菌infB基因序列的基础上，设计了特异性引物，所述的特异性引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N01/SEQ IDN02所示:正向引物的核苷酸序列(SEQ ID N01)为:CTCTGCTAAATCGGGGACGG ;反向引物的核苷酸序列(SEQ ID N02)为:CACGAGCTTTCTTCTCGTCC。本专利技术还提供一种用于欧美杨溃瘍病菌Lonsdalea quercina subsp.populi的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。所述试剂盒还可以包括PCR反应试剂盒。PCR反应试剂盒可以从商业途径获得，也可以自己配置。本专利技术还进一步提供了一种检测欧美杨溃瘍病菌Lonsdalea quercina subsp.populi的方法,所述方法包括下述步骤:I)挑取待测菌株菌落或提取待测菌株基因组DNA作为PCR扩增模板，采用上述引物进行PCR扩增；2 )对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。PCR 反应的扩增体系为 20 μ I，反应体系为:2XN1-Taq PCR MasterMix 10.0 μ I,待测菌株基因组 DNA 1.0 μ Ι,ΙΟμΜ/L 引物(SEQ ID NO I/SEQ ID N02)各 I μ 1，ddH207.0 μ I。在上述方法中，挑取待测菌株菌落作为PCR扩增模板时，PCR扩增的条件为94°C预变性5min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，30-35个循环；最后72°C延伸6min。在上述方法中，提取待测菌株基因组DNA作为PCR扩增模板时，PCR扩增的条件为:94°C预变性3min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，30-35个循环；最后72°C延伸 6min。 在上述方法中，琼脂糖凝胶的浓度为I~1.5% (g/mL)，琼脂糖凝胶电泳的电压为4~6v/cm,欧美杨溃瘍病菌菌株的琼脂糖凝胶电泳特异性条带出现在341bp处。本专利技术利用生物信息和生物学知识，通过一系列实验筛选，发现infB基因具有与其它菌所不同的特异性位点，并利用这一特异位点设计并筛选出相应的引物，利用该对引物对 Brenneria quercina ATCC29281, Lonsdalea quercina subsp.1bericaLMG26264, Lonsdalea quercina subsp.britannica LMG26267 三株标准菌株及其它细菌共47个菌株进行特异性验证。试验结果表明，该引物只能从欧美杨溃疡病菌菌株中得到341bp的条带。其它菌株，特别是三株与欧美杨溃瘍病病菌十分近似的标准菌株无条带。利用该引物对不同来源地区的欧美杨溃疡病菌菌株均可得到341bp的条带，表明该基因的这个特异性位点适合作为欧美杨溃疡病菌分子检测的特异性位点，基于该位点的特异性引物可对欧美杨溃疡病进行准确地诊断和检测。本专利技术检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品中是否存在欧美杨溃疡病菌，为欧美杨溃疡病田间调查，病害监测提供有效手段。本专利技术能快速、准确、简便地从杨树组织中检测出病原菌。欧美杨栽培范围广阔，受溃疡病病原细菌侵染的可能性很大，应用本专利技术对病原菌进行早期检测，为控制欧美杨溃疡病提供了重要基础，在生产上有广泛的应用价值。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术对欧美杨溃疡病菌检测的实验结果；图2为本专利技术检测方法的灵敏度实验结果；图3是本专利技术对欧美杨中林46杨植物组织的检测结果。【具体实施方式】下面以附图和【具体实施方式】对本专利技术作进一步详细的说明。一、引物设计与合成特异性引物SEQ ID NO I/SEQ ID N02的设计:对GenBank中的欧美杨溃疡病菌的infB基因和Lonsdalea quercina其它亚种及其它近缘种中的infB基因序列进行比较分析，设计了一对特异性引物SEQ ID NO I/SEQ ID N02。设计的引物重新在GenBank中BLAST分析验证其特异性。所有引物委托北京天一辉远生物科技有限公司合成。SEQ ID NOl:CTCTGCTAAATCGGGGACGGSEQ ID N02:CACGAGCTTTCTTCTCGTCC二、PCR扩增方法的建立1、PCR反应体系PCR 反应体系为 20 μ 1，反应体系为:2XN1-Taq PCR MasterMix 10.0 μ 1，菌落或者植物基因组 DNA 1.0 μ Ι,ΙΟμΜ/L 引物(SEQ ID NO I/SEQ ID N02)各 I μ 1，ddH207.0 μ I。2、PCR反应条件挑取待测菌株 菌落作为PCR扩增模板时，PCR扩增的条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s，60。。退火30s，72。。延伸lmin, 30~35个循环；最后72°C延伸6min。提取待测菌株基因组DNA或者植物组织DNA作为PCR扩增模板，PCR扩增的条件为:94本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性引物，其特征在于，所述引物由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为：CTCTGCTAAATCGGGGACGG；反向引物的核苷酸序列为：CACGAGCTTTCTTCTCGTCC。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：商靖，贺伟，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：