本发明专利技术公开了一种应用静息细胞转化1,3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法，属于生物工程领域。本发明专利技术首先利用快速筛选法筛选出一株具有高转化性能、高生产能力的微生物菌株，经鉴定为醋杆菌（Acetobacter?sp.）JDB-71，并利用该菌静息细胞在水相体系中高效催化1,3-丙二醇为3-羟基丙酸，所得醋杆菌培养工艺简单、转化效率高、产物产量大、转化液成分简单利于产品分离纯化、转化过程可以人为地调节菌体浓度以缩短生产时间，节约大量的能源和生产成本。
【技术实现步骤摘要】
,3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法【专利摘要】本专利技术公开了,3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法，属于生物工程领域。本专利技术首先利用快速筛选法筛选出一株具有高转化性能、高生产能力的微生物菌株，经鉴定为醋杆菌（Acetobacter?sp.）JDB-71，并利用该菌静息细胞在水相体系中高效催化1,3-丙二醇为3-羟基丙酸，所得醋杆菌培养工艺简单、转化效率高、产物产量大、转化液成分简单利于产品分离纯化、转化过程可以人为地调节菌体浓度以缩短生产时间，节约大量的能源和生产成本。【专利说明】 ’ 3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法
本专利技术涉及，3_丙二醇为3-羟基丙酸的方法，尤其是以一株醋杆菌及其静息细胞应用于转化1，3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法，属于生物工程领域。
技术介绍
3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,简称3-HP),又名β_羟基丙酸,与乳酸互为同分异构体，因其碳链两端分别具有一个羟基和羧基，是一种具有很高价值的化学中间体，如通过羧基还原可得到醇或醛，与醇反应得到酯或转化为酰胺及其衍生物，通过羟基氧化得到醛或二酸，脱水转化为不饱和化合物，聚合得到生物可降解高分子材料等，此外，Schwarz等的研究数据显示3-羟基丙酸能够杀死寄生于植物内的线虫(M.1ncognita)且不会诱导其产生耐药性，正因为其具有这么多潜在的价值，美国能源部将其列为最具潜力的化工产品之一。目前3-羟基丙酸的生产方法主要有化学合成法、微生物发酵法和微生物转化法。传统的3-羟基丙酸化学合成法是将3-羟基丙腈(氰化钾与邻卤代醇反应)水解。此外，沈长洲等在1995年报道了丙烯酸高温水合法生产3-羟基丙酸。Haas等1998年提出3-HPA钼金催化法生产3-羟基丙酸。2000年Ishida等提出一种丙烯酸固体酸水合法，该方法以ZSMSzeolite为催化剂。化学合成法在碳末端引入功能团有很大的难度，副反应多、工艺要求较高、副产物较多不易分离提纯，生产成本较高，操作复杂，生产过程存在不安全因素，产量较低。微生物发酵法主要是通过基因工程的方法构建工程菌，其主要的策略有两种:以葡萄糖为底物的生产途径和以甘油为底物的生产途径，但是发酵法具有菌种不稳定、生产周期长、产物提纯过程繁琐、转化率低、产量低、产品纯度低、含有相当量的3-羟基丙酸醚键二聚体等不足。在上世纪60年代，已开始了微生物转化法制备3-羟基丙酸的研究。Harada等研究Hansenula miso菌时首次发现该菌株可以通过氧化1，3-丙二醇得到3-羟基丙酸；Miyoshi等在研究Fusarium merismoides菌时发现该菌可以利用丙酸羟基化来生产3_羟基丙酸；Hasegawa等发现一株不积累丙酸的突变株Candida rugosa能以2%丙酸为底物生产3-羟基丙酸,产率达89% ；Takamizawa等利用微生物转化丙烯酸生产3_羟基丙酸，在7%丙烯酸和2%葡萄糖培养基中，以氢氧化钙调节pH，经过Ild的培养转化，得到4.8%的3-羟基丙酸。 本专利技术的创新之处在于提供了一株高转化1，3-丙二醇性能、高生产3-羟基丙酸能力的醋杆菌(Acetobacter sp.),并首次报道了利用利用其静息细胞催化1，3_丙二醇转化为3-羟基丙酸的方法，具有微生物培养工艺简单、转化效率高、产物产量大、转化液成分简单，以3-羟基丙酸为主要成分，其他成分含量较少，利于产品分离纯化、转化过程可以人为地调节菌体浓度以缩短生产时间，节约大量的能源和生产成本，利于推广。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个问题是提供一株新的醋杆菌(Acetobacter sp.),于2013年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院，保藏编号为CGMCC N0.8142。所述醋酸杆菌是从不同地域采集到的土壤中筛选得到，能够以1，3-丙二醇为底物高效转化生产3-羟基丙酸。本专利技术要解决的第二个问题是提供一种利用醋杆菌静息细胞转化1，3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法，是利用所述醋杆菌，在水相体系中，以1，3-丙二醇为底物进行生物催化反应生产3-羟基丙酸，具体步骤如下:(I)菌株的培养:发酵培养基(g/L):葡萄糖10-100，酵母膏1-10，蛋白胨1-10，PH3-10 ;培养温度20-40°C ;摇床转速100-300rpm ;培养时间1_3天，将发酵液离心获得菌体。(2)催化反应体系的建立:菌体经两次洗涤后用缓冲液配制成一定pH (3-10)的菌体悬浮液，菌体浓度2-50g/L，加入终浓度为l-100g/L的1，3-丙二醇，进行单一水相催化反应，催化温度20-40°C，摇床转速100-300rpm，催化时间l_72h。所述缓冲液可以是柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；所用缓冲液体系浓度为0.05-0.5mol/L ；pH范围在3_10。(3)转化液的处理与分析:微生物催化后的反应液经离心去除菌体后，反应液经0.22 um的水相滤膜过滤后进行HPLC检测。本专利技术的有益效果:本专利技术首先通过快速筛选技术筛选到了一株具有高转化1，3-丙二醇性能、高生产3-羟基丙酸能力的醋杆菌(Acetobacter sp.)JDB_71。在水相体系中高效的转化1，3-丙二醇为3-羟基丙酸，在l_50g底物浓度范围内，产物的转化率高达85%以上，利用该菌株静息细胞转化1，3-丙二醇生产3-羟基丙酸的方法培养工艺简单、转化效率高、转化液成分简单，以3-羟基丙酸为主要成分，其他成分较少，利于产品分离纯化、产物产量大、转化时间短、转化过程可以人为地调节菌体浓度以缩短生产时间，节约大量的能源和生产成本。【专利附图】【附图说明】图1:3_羟基丙酸标样液相色谱图图2:静息细胞转化液液相色谱图图3:3_羟基丙酸标样质谱图图4:静息细胞转化液质谱图图5:不同1，3-丙二醇浓度下3-羟基丙酸的产量，▲:转化率图6 ;不同pH对初始催化速率的影响图7:不同催化温度对初始催化速率的影响图8:不同菌体浓度对初始催化速率的影响【具体实施方式】实施例1高转化1，3-丙二醇性能、高生产3-羟基丙酸能力微生物菌株的筛选富集培养基(g/L):葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨2。平板筛选培养基(g/L):葡萄糖20，酵母膏5，琼脂20，CaC0310 (单独灭菌后加入),无水乙醇30 (培养基灭菌完成后加入)。种子培养基、发酵培养基(g/L):葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨2，ρΗ6.0。分析方法:通过HPLC进行3-羟基丙酸的检测，色谱柱:B10RAD ΗΡΧ-87Η色谱柱；流动相0.005mol/L浓硫酸；流速0.6mL/min ;检测温度60°C ;检测波长210nm。将采集到的不同地域土壤加入到含有玻璃珠的无菌生理盐水中震荡Ih后静置取上清液加入富集培养基中进行静置培养2-4天，待培养基表面长出菌膜后取一定量的菌膜再次接种富集培养基中，将培养好的菌液进行梯度稀释然后涂布到平板筛选培养基上，20-40°C培养2-4天挑取透明圈直径与菌落直径比值较大的单菌落进行催化验证。将筛选得到的单菌落接入种子培养基(50mL/250mL)中，30°C，220本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株具有高转化1,3?丙二醇生产3?羟基丙酸能力的醋杆菌（Acetobacter?sp.）JDB?71，于2013年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC?NO.8142。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛斌，吴金鑫，宗红，陆信曜，宋健，方慧英，诸葛健，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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