熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法和用途，该方法是将熊果酸和H22细胞共培养，采用常规方法制备肝癌细胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，结果表明熊果酸为佐剂的疫苗免疫小鼠后，荷瘤小鼠肿瘤的生长明显抑制，小鼠的生命延长率明显高于模型组，胸腺等免疫器官得到保护，脾淋巴细胞增殖能力显著升高，血清中细胞因子IL-2、IL-4含量明显升高，CD4+/CD8+T细胞含量比例明显升高，免疫荧光显示免疫小鼠血清可与H22细胞发生特异性结合，ELISA从血清中检测到高滴度抗体。熊果酸作为佐剂制备的肝肿瘤全细胞疫苗，可有效的提高肝肿瘤疫苗的免疫原性，通过该方法获得的熊果酸免疫佐剂疫苗安全，无毒，来源广泛，克服了目前免疫佐剂单一，免疫效果低，副作用难以避免的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法和用途，属于生物工程和生物免疫学领域。
技术介绍
肝癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，治愈性肝切除以及肝移植是目前肝癌病人的首选方法，但是由于肝癌的肝内多发病灶、肝外转移及供体缺乏的因素，诊断出的病人中仅有10% 15%的病人可以接受手术治疗。临床资料还显示，大多数肝癌患者对化疗、放疗不敏感，且对正常细胞造成一定的损害，毒副反应大，易复发，因此肝癌的临床治疗迫切地需要新技术和新方法。近年来，肿瘤免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗后另一种很有前途的治疗手段。其吸引人之处在于能够激发患者自身免疫系统，诱发高特异性免疫反应，不仅实现对肿瘤病灶的肿瘤细胞的特异性杀伤，而且还可以消除血液和淋巴系统中的癌细胞，有效地阻止癌细胞转移，因此，成为近年来国内外研究的热点。肝肿瘤细胞疫苗是将自身或异体同种肝癌细胞经过物理因素(照射、高温)、化学因素(酶解)以及生物因素(病毒感染、基因转染等)的处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性，免疫机体，刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫，以达到治疗肝癌、预防肝癌转移和复发的目的。然而，肿瘤疫苗研制过程中存在的一个共同问题是大多数肿瘤抗原的免疫原性弱，抗原表位少，表达分布不同，很难引起机体特异性免疫应答，需添加佐剂来增强其免疫原性。铝盐佐剂是目前唯一全球公认的人用佐剂，但存在对蛋白亚单位疫苗诱导抗体产生的能力较弱，激发细胞免疫应答能力差等，而且在某些情况下，还会产生与过敏反应有关的IgE，其副作用难以避免。因此，需要研发更为安全有效的人用新型佐剂，尤其是安全无毒、能够刺激较强细胞免疫应答的佐剂。近年来，从药用植物中提取安全、高效的自然组分作为免疫佐剂成为佐剂·研究的趋势。熊果酸(Ursolic acid, UA),又名乌索酸、乌苏酸,是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物，以游离形式或与糖结合成苷的形式分布于枇杷叶、熊果、女贞子、山楂、车前草、夏枯草、白花蛇舌草等多种植物中。研究发现其具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖、抗肿瘤、增强免疫功能等多种生物学效应。经系统查阅文献和专利资料，目前未发现熊果酸在抗肿瘤免疫佐剂方面的用途。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法和用途，该方法是将熊果酸和H22细胞共培养，采用常规方法制备肝癌细胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，结果表明熊果酸为佐剂的疫苗免疫小鼠后，荷瘤小鼠肿瘤的生长明显抑制，小鼠的生命延长率明显高于模型组，胸腺等免疫器官得到保护，脾淋巴细胞增殖能力显著升高，血清中细胞因子IL-2、IL-4含量明显升高，⑶47⑶8+T细胞含量比例明显升高，免疫荧光显示免疫小鼠血清可与H22细胞发生特异性结合，ELISA从血清中检测到高滴度抗体。熊果酸作为佐剂制备的肝肿瘤全细胞疫苗，可有效的提高肝肿瘤疫苗的免疫原性，通过该方法获得的熊果酸免疫佐剂疫苗安全，无毒，来源广泛，克服了目前免疫佐剂单一，免疫效果低，副作用难以避免的问题。本专利技术所述的一种熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法，按下列步骤进行: a、在对数生长期H22肿瘤细胞5X IO7个接种于Iml含灭活的10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，加入20 μ mol/mL的熊果酸培养48h ； b、离心弃上清液，剩余物细胞悬浮于Iml生理盐水中，再放入液氮中冷冻，时间5-10分钟，再将冷冻物取出，放入温度37°C水融化，反复5-8次，即可得到熊果酸免疫佐剂疫苗。一种所述方法获得的熊果酸作为免疫佐剂疫苗的用途，该熊果酸作为免疫佐剂疫苗在制备抗肝肿瘤全细胞的疫苗。一种所述方法获得的熊果酸作为免疫佐剂疫苗的用途，该熊果酸作为免疫佐剂疫苗在制备预防肝肿瘤全细胞的疫苗。本专利技术所述的一种熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法和用途，其中熊果酸的结构式为:.H Pcooh I Hi,.H 1: 本专利技术所述的一种熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法，通过该方法获得的熊果酸免疫佐剂疫苗中，包含至少一种能激活生物体特异性抗肿瘤T淋巴细胞的活性成分；其中所述的活性成分为蛋白质、多肽、脂类、蛋白质多肽复合物、DNA分子、RNA分子、肿瘤相关抗原或特异性肿瘤抗原。本专利技术所述的一种熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法和用途，通过所述方法获得的熊果酸作为免疫佐剂疫苗在制备抗肝癌肿瘤全细胞和预防肝癌肿瘤全细胞的新用途，其中: (1)、小鼠肝肿瘤全细胞免疫疫苗的制备:采用熊果酸与小鼠给肿瘤细胞共培养后，反复冻融，获得小鼠肝肿瘤全细胞免疫疫苗； (2)、建立小鼠免疫模型，检测各个组的免疫小鼠存活情况，结果表明全细胞疫苗组可明显提高小鼠的成活率及延长小鼠的生存天数；而且全细胞疫苗组可抑制肿瘤的快速生长; (3)、小鼠免疫模型各组中，全细胞疫苗组可以在一定程度上保护小鼠的免疫器官，增强淋巴细胞的活性，提高⑶47⑶8+比值，提高细胞因子IL-2、IL-4的表达量； (4)、利用免疫荧光检测小鼠免疫模型各组中抗原、抗体结合情况，结果表明，免疫成功小鼠血清中存在与肿 瘤抗原结合的特异抗体，而且体液中特异性抗体IgG的表达也得到了提闻。(全细胞+UA)疫苗免疫小鼠后，胸腺等免疫器官得到保护，脾淋巴细胞增殖能力显著升高，⑶47⑶8+T细胞含量比例明显升高，血清中细胞因子IL-2、IL-4含量明显升高，免疫荧光显示免疫小鼠血清可与H22细胞发生特异性结合，ELISA从血清中检测到高滴度抗体。本专利技术的有益效果是:熊果酸作为佐剂制备的肿瘤全细胞疫苗，可有效的提高肿瘤疫苗的免疫原性，提高小鼠的生存率及生存天数，保护肝肿瘤导致的脾免疫器官异常增大、增强细胞免疫活性，调节免疫细胞亚群和细胞因子的作用，可作为抗肝肿瘤免疫佐剂；其另外一个优势是安全，无毒，来源广泛。附图说明图1为本专利技术免疫小鼠生长过程中体重的变化图，其中一 一为模型组，一■一为熊果酸组，一▲一为细胞组，一X—为疫苗组，一 一为空白组； 图2为本专利技术接种肿瘤后，肿瘤生长曲线图，其中一 一为模型组，一▲一为熊果酸组，一.一为细胞组，一 一为疫苗组； 图3为本专利技术免疫各组的细胞因子IL-2 (a) IL-4 (b)的变化 图4为本专利技术荧光显微镜观察免疫血清抗体(X20) 图5为本专利技术免疫各组血清中IgG的表达情况图。具体实施例方式实施例1 本专利技术所述的一种熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法，按下列步骤进行: a、在对数生长期H22肿瘤细胞5X IO7个接种于Iml含灭活的10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，加入20 μ mol/mL的熊果酸培养48h ； b、离心弃上清液，剩余物细胞悬浮于Iml生理盐水中，再放入液氮中冷冻，时间5-10分钟，再将冷冻物取出，放入温度37°C水融化，反复5-8次，即可得到熊果酸免疫佐剂疫苗。实施例2 通过本专利技术所述方法获得的熊果酸作为免疫佐剂疫苗在制备抗肝肿瘤全细胞或预防肝肿瘤全细胞的用途: 小鼠肝癌疫苗的免疫模型的建立: 小鼠随机分为5组，每组10只，分别为空白组、模型组、熊果酸免疫组、细胞免疫组、熊果酸细胞共培养免疫组(简称疫苗免疫组); 熊果酸免疫组为在Iml生理盐水中加入熊果酸至终浓度为20ymol/L，细胞免疫组为在Iml含10%胎牛血清的RP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种熊果酸作为免疫佐剂疫苗的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：a、在对数生长期H22肿瘤细胞5×107个接种于1ml含灭活的10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，加入20μmol/mL的熊果酸培养48h；b、离心弃上清液，剩余物细胞悬浮于1ml生理盐水中，再放入液氮中冷冻，时间5?10分钟，再将冷冻物取出，放入温度37℃水融化，反复5?8次，即可得到熊果酸免疫佐剂疫苗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓波，李艳红，陆雪莹，肖向文，
申请(专利权)人：中国科学院新疆理化技术研究所，
类型：发明
国别省市：