使用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种使用肠杆菌科的细菌产生L-氨基酸的方法，例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸或L-谷氨酸，其中已经对所述细菌进行了修饰以增强由adhE基因编码的野生型醇脱氢酶或对有氧失活有抗性的突变醇脱氢酶的活性。

【技术实现步骤摘要】
使用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法本申请是申请日为2007年7月12日，申请号为“200780027157.1”(国际申请号为“？07见2007/064304”)，名称为“使用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及微生物工业，具体涉及通过使用具有增强的醇脱氢酶活性的细菌进行发酵来产生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。
技术介绍
常规而言，在工业上通过利用从天然来源获得的微生物菌株或其变体的发酵方法产生L-氨基酸。通常对微生物进行修饰以提高L-氨基酸的产率(production yield)。已经报道过许多提高L-氨基酸产率的技术，包括用重组DNA转化微生物(美国专利N0.4，278，765)。用于提高产率的其它技术包括增加氨基酸生物合成中涉及的酶的活性和/或使目标酶对产生的L-氨基酸的反馈抑制脱敏(美国专利Nos.4，346，170,5,661,012和 6，040，160)。通过优化期望的化合物的主要生物合成途径，能够实现对产生L-氨基酸的菌株的进一步改进。通常这通过为细菌补充越来越大量的碳源(如糖，例如葡萄糖)来实现。无论通过PTS的葡萄糖转运的效率为何,但是在高产菌株中对碳源的获取(access)却仍可能不足。另一种增加产生L-氨基酸的菌株的生产力和降低目标L-氨基酸成本的方法是使用替代性(alternative)的碳源,如醇,例如乙醇。大肠杆菌的醇脱氢酶(乙醇氧化还原酶，AdhE)是一种多功能酶，其通过两个连续的NADH-依赖性乙酰辅酶A还原反应，以及使将丙酮酸切割成乙酰辅酶A和甲酸的丙酮酸甲酸裂合酶来催化乙醇的发酵生产。AdhE在葡萄糖存在下在厌氧生长的过程中大量合成(约3xl04拷贝每细胞)，并形成称为螺旋体(spirosome)的螺旋结构，这些螺旋结构大约0.22 μ m长，含有 40-60 个 AdhE 分子(Kessler, D.，Herth, W.和 Knappe, J.，J.Biol.Chem.，267，18073-18079 (1992))。当将大肠杆菌细胞培养从厌氧条件转换至有氧条件时，adhE基因的转录降低，并维持在于厌氧条件下所得范围的10%以内(Chen，Y.Μ.和 Lin, E.C.C., J.Bacteriol.173, 8009-8013 (1991) !Leonardo, M.R.，Cunningham, P.R.和 Clark, D.P., J.Bacteriol.175, 870-878 (1993) ；Mikulskis, A., Aristarkhov, A.和 Lin, E.C.C.，J.Bacteriol.179，7129-7134(1997) ；MembriIlo-Hernandez, J.和Lin, E.C.C.，J.Bacteriol.181，7571-7579 (1999))。翻译也受到调节，并且需要 RNA 酶III (Membrillo-Hernandez, J.和 Lin, E.C.C., J.Bacteriol.181, 7571-7579(1999)；Aristarkhov, A.等，J.Bacteriol.178，4327-4332 (1996))。已将 AdhE 鉴定为大肠杆菌细胞经受过氧化氢应激 (hydrogen peroxide stress)时的主要祀物之一(Tamarit, J., CabiscoI, E.和 Ros, J., J.Biol.Chem.273, 3027-3032 (1998))。尽管由AdhE催化的两个NADH-偶联反应具有可逆性，野生型大肠杆菌也无法在乙醇作为唯一碳源和能源存在时生长，因为adhE基因在有氧条件下以低水平转录(Chen，Y.Μ.和 Lin, E.C.C., J.Bacteriol.73, 8009-8013 (1991) ; Leonardo, M.R., Cunningham, P.R.&Clark, D.P.，J.Bacteriol.175870-878 (1993))，并且在有氧代谢过程中 AdhE 蛋白的半衰期因金属催化的氧化(MCO)而缩短。已经分离并表征了能够在乙醇作为唯一碳源和能源时进行有氧生长的大肠杆菌突变体(在37° C，具有取代Ala267Thr的突变体，在乙醇存在下生长，倍增时间为240分钟；具有取代Ala267Thr和Glu568Lys的变体，倍增时间为90分钟)(Membrillo-Hernandez, J.等,J.Biol.Chem.275, 33869-33875(2000) ；Holland-Staley,C.A.等，J.Bacteriol.182, 6049-6054(2000)) 0显然，当按照与生理上的方向相反的方向催化两个连续反应时，对于野生型AdhE而言乙酰辅酶A的形成是速率受限的。作为通过AdhE中的A267T取代来改进Vmax的交换(tradeoff)是酶的热稳定性降低和对MCO损坏的敏感性增加。AdhE中的第二氨基酸取代E568K(A267T/E568K)部分恢复了蛋白质稳定性和对MCO损坏的抗性，而未进一步改进在底物氧化中的催化效率。然而，迄今尚未有报道使用肠杆菌科(Enterobacteriaceaefamily)细菌通过在含有乙醇的培养基中发酵来增加L-氨基酸的产生，所述肠杆菌科细菌具有活性增强的对有氧失活(aerobic inactivation)有抗性的天然醇脱氢酶或突变醇脱氢酶。专利技术概述本专利技术的目的包括提高产生L-氨基酸的菌株的生产力，和提供使用这些菌株产生非芳族或芳族L-氨基酸的方法。通过发现在处于有氧培养条件下有功能的启动子的调控下表达编码醇脱氢酶的天然或突变adhE基因使L-氨基酸(例如，L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和/或L-亮氨酸)的产生增强而达到了该目的。本专利技术的目的是提供用于产生L-氨基酸的方法，其包括:A)在含有乙醇的培养基中培养具有醇脱氢酶的肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，和B)从培养基中分离L-氨基酸，其中编码所述醇脱氢酶的基因在非天然启动子的调控下表达，所述非天然启动子在有氧培养条件下有功能。本专利技术进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述非天然启动子选自下组:Ptac、Plac、 Ptrp^ Ptrc^Rin Pl。本专利技术进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶对有氧失活有抗性。本专利技术进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶源于选自下组的细菌:大肠杆菌(Escherichia coli)、胡萝卜软腐欧文氏菌(ErwiniacaFotovora)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、 Pantoea ananatis (菠萝泛菌)、植物乳杆菌(LactobacillusPI ant arum)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生L?氨基酸的方法，其包括：A)在含有乙醇的培养基中培养具有醇脱氢酶的肠杆菌科的产生L?氨基酸的细菌，和B)从培养基中分离L?氨基酸，其中编码所述醇脱氢酶的基因在非天然启动子的调控下表达，所述启动子在有氧培养条件下有功能，并且其中所述产生L?氨基酸的细菌是大肠杆菌或Pantoea?ananatis。

【技术特征摘要】
2006.07.19 RU 2006125964;2007.01.19 US 60/885,6711.一种用于产生L-氨基酸的方法，其包括: A)在含有乙醇的培养基中培养具有醇脱氢酶的肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，和 B)从培养基中分离L-氨基酸， 其中编码所述醇脱氢酶的基因在非天然启动子的调控下表达，所述启动子在有氧培养条件下有功能，并且 其中所述产生L-氨基酸的细菌是大肠杆菌或Pantoea ananatis。2.根据权利要求1的方法，其中所述非天然启动子选自下组:Pta。、Pla。、Ptrp>Ptrc>匕和PL。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述醇脱氢酶对有氧失活有抗性。4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶源于选自下组的细菌 大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、Pantoeaananatis、植物乳杆菌和乳酸乳球菌。5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQID N0:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为不是天冬氨酸残基的另一种氨基酸残基。6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQID N0:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为赖氨酸残基。7.根据权利要求5或6的方法，其中所述醇脱氢酶具有至少一个...

【专利技术属性】
技术研发人员：利奥尼德R普蒂特辛，伊里纳B奥尔特曼，韦罗妮卡A科特利亚罗瓦，奥尔佳N莫科瓦，塔蒂亚纳A亚姆波尔斯卡亚，尤里I科兹洛夫，寺下优，臼田佳弘，松井和彦，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：