人工植物微染色体制造技术

描述了包含能特异性结合着丝粒蛋白C(CENPC)的功能性着丝粒的人工植物微染色体以及所述微染色体的制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物生物工程领域，具体地讲，涉及人工微染色体以及在植物中制备这类微染色体的方法。
技术介绍
目前在染色体工程上的进展使得改变植物基因组成为可能，因此可改变其表型。当转基因整合到植物基因组时，通常是以随机方式，而且拷贝数无法预知。因此，研究工作直接针对更好地控制转基因整合。如果有这样的需要，研究人员想知道答案是否在于使用人工微染色体。它们是由顺式作用(cis-acting)DNA序列元件构建的人工制备的线状或环状DNA分子,所述序列元件可提供所构建微染色体的复制和分配。据信，人工染色体的产生将会减少或消除与随机基因组整合到天然植物染色体相关的问题，例如因转基因与宿主植物基因组材料结合而造成的连锁拖曳(linkage drag)。人工染色体也可提供比标准转化载体多10-100倍的基因的递送方法，并提供大染色体区段，用于互补和/或基于图谱的克隆。对于人工染色体复制、稳定性和维持/遗传，已经鉴定出3种组分:(i)作为复制起点的自主复制序列；(ii)起到稳定和维持线状染色体末端作用的端粒，(iii)作为动粒装配位点的着丝粒，用于有丝分裂和减数分裂中染色体的适当分离。来自单细胞生物(例如酵母)的分离着丝粒在高等真核生物中不起作用。美国专利5，270，201 (1993年12月14日授予Richards等人)描述了基于端粒和任选着丝粒的植物人工染色体。美国专利7，119，250(2006年10月10日授予Luo等人)描述了植物着丝粒的组成。美国专利7，132，240 (2006年11月7日授予Richards等人)描述了从任何生物的着丝粒中有效分离甲基化着丝粒DNA的可行方法。美国专利7，193，128 (2007年3月20日授予Copenhaver等人)描述了用植物着丝粒的核酸序列来产生或增加作物收益的方法。2007年3月15日公布的公布号为W02007/030510的PCT申请描述了用自主微染色体转化植物的制备方法。专利技术概沭 本专利技术涉及包含功能性着丝粒的人工植物微染色体，其包含:(a)至少2个反向CentC串联重复序列阵列，其中第I阵列包含至少50个拷贝的CentC，第2阵列包含至少50个拷贝的CentC ;和(b)至少一个拷贝的反转录转座元件，其中反转录转座元件位于第I阵列和第2阵列之间。在第2个实施方案中，本专利技术的人工植物微染色体包含选自CentA、CRMl和CRM2的反转录转座元件。在第3个实施方案中，本专利技术的人工植物微染色体还包含至少一个功能性端粒。在第4个实施方案中，人工植物微染色体所包含的功能性着丝粒与着丝粒蛋白C(CENPC)特异性结合。在第5个实施方案中，玉米植物(corn plant)可包含任何本专利技术的人工微染色体。在第6个实施方案中，本专利技术涉及包含功能性着丝粒的人工植物微染色体，其中着丝粒与着丝粒蛋白C(CENPC)特异性结合。在第7个实施方案中，本专利技术涉及分离的多核苷酸，其包含:(a)至少2个反向CentC串联重复序列阵列，其中第I阵列包含至少10个拷贝的CentC，第2阵列包含至少10个拷贝的CentC ;和(b)至少一个拷贝的反转录转座元件，其中反转录转座元件位于第I阵列和第2阵列之间。在第8个实施方案中，本专利技术的分离多核苷酸包含选自CentA、CRMl和CRM2的反转录转座元件。在第9个实施方 案中，本专利技术涉及分离的多核苷酸，其包含:(a)至少一个CentC串联重复序列阵列，该阵列包含至少10个拷贝的CentC;和(b)至少一个拷贝的选自CentA、CRMl和CRM2的反转录转座元件。在第10个实施方案中，本专利技术涉及分离的多核苷酸，其包含:(a)至少一个CentC串联重复序列阵列，该阵列包含至少10个拷贝的CentC ;和(b)CentA、CRMl和CRM2各自至少一个拷贝。在第11个实施方案中，本专利技术涉及重组构建体以及包含这类重组构建体的转基因玉米植物，所述构建体包含本专利技术的分离多核苷酸。在第12个实施方案中，本专利技术涉及包含具有功能性着丝粒的人工植物微染色体的转基因玉米植物的制备方法，所述方法包括:(a)使至少一个玉米植物细胞与包含本专利技术重组构建体的混合物接触；(b)鉴定来自步骤(a)并包含具有功能性着丝粒的人工植物微染色体的至少一个玉米植物细胞；和(C)使来自步骤(b)的玉米植物细胞再生出能育的玉米植物，其中所述玉米植物包含具有功能性着丝粒的人工植物微染色体。所述混合物还可包含编码用于刺激细胞生长的多肽的多核苷酸，其中该多肽选自wuschel、baby boom、RepA或Lecl。附图简沭本专利或申请文件包括至少一幅彩色附图。如有需要并支付必要费用后，专利办公室将会提供带彩图的本专利或专利申请公布说明书副本。根据作为本申请组成部分的以下详述和附图及序列表，可以更全面地理解本专利技术。附图说明图1.来自H1-1I转化CMC3库I事件#14的玉米胚胎发生愈伤组织(embryogeniccalli)的有丝分裂染色体铺片(spread)的荧光原位杂交(FISH)。愈伤组织源自用Tn5_3改型(retrofit)的线性化BAC克隆库I转化的未成熟胚。前中期(左)和中期(右)核都显示出20条天然染色体和I条微染色体(箭头和插图)。这两种微染色体对CentC(绿色一颜色；白色一灰度)着丝粒特异性重复序列和对转化构建体具有特异性的独特标记探针23715(红色一颜色；白色一灰度)都呈阳性，其中CentC和23715基本上共同定位(colocalize)于微染色体(插图)。图2.来自H1-1I转化CMC3库I事件#14的玉米胚胎发生愈伤组织的有丝分裂染色体铺片的FISH。愈伤组织源自用Tn5-3改型的线性化BAC克隆库I转化的未成熟胚。图A显示中期核，显示出20条天然染色体和2条微染色体(方框)。这两种微染色体对CentC (绿色一颜色；白色一灰度)着丝粒特异性重复序列和对转化构建体具有特异性的独特标记探针23715 (红色一颜色；白色一灰度)都呈阳性。图B-D是该方框的更高放大倍数图，显示出微染色体(箭头)，其中:B-RDAPI ;C-DAPI+23715探针(红色一颜色；白色一灰度);和D-DAPI+CentC探针(绿色一颜色；白色一灰度)。图3.来自H1-1I转化CMC3库I事件#14的玉米胚胎发生愈伤组织的有丝分裂染色体铺片的免疫荧光。愈伤组织源自用Tn5-3改型的线性化BAC克隆库I转化的未成熟胚。图A显示中期核，显示出20条天然染色体和I条微染色体(箭头)。天然染色体和微染色体的所有着丝粒对着丝粒蛋白C(即CENPC，一种着丝粒/动粒特异性蛋白)(红色一颜色；白色一灰度)都呈阳性。图B-C是微染色体的更高放大倍数图，其中=B-RDAPI ;和C-DAPI+CENPC(红色一颜色；白色一灰度)。CENPC的形态和免疫学定位表明，微染色体由各自具有功能性着丝粒的两条姊妹染色单体组成。图4.图A-来自H1-1I转化CMC3库I事件#14的玉米胚胎发生愈伤组织的有丝分裂染色体铺片的免疫荧光。愈伤组织源自用Tn5-3改型的线性化BAC克隆库I转化的未成熟胚。在分裂后期观察到天然染色体和微染色体(方框)的姊妹染色单体分离。天然染色体和微染色体的所有着丝粒对着丝粒蛋白C(即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备包含具有功能性着丝粒的人工植物微染色体的转基因玉米植物的方法，所述方法包括：(a)使至少一个玉米植物细胞与下述混合物接触，所述混合物包含具有相反方向CentC重复序列的、库化的着丝粒特异性的BAC组或单个的BAC克隆；(b)鉴定来自步骤(a)并包含具有功能性着丝粒的人工植物微染色体的至少一个玉米植物细胞；所述的着丝粒具有至少2个反向CentC串联重复序列阵列；和(c)使来自步骤(b)的玉米植物细胞再生出能育的玉米植物，其中所述玉米植物包含具有功能性着丝粒的人工植物微染色体。

【技术特征摘要】
2006.05.17 US 60/801,0041.一种用于制备包含具有功能性着丝粒的人工植物微染色体的转基因玉米植物的方法，所述方法包括: (a)使至少一个玉米植物细胞与下述混合物接触，所述混合物包含具有相反方向CentC重复序列的、库化的着丝粒特异性的BAC组或单个的BAC克隆； (b)鉴定来自步骤(a)并包含具有功能性着丝粒的人工植物微染色体的至少一个玉米植物细胞；所述的着丝粒具有至少2个反向CentC串联重复序列阵列；和 (c)使来自步骤(b)的玉米植物细胞再生出能育的玉米植物，其中所述玉米植物包含具有功能性着丝粒的人工植...

【专利技术属性】
技术研发人员：E阿纳尼伊夫，MA钱伯林，WJ戈顿坎姆，S斯维塔舍，吴成仓，
申请(专利权)人：先锋高级育种国际公司，
类型：发明
国别省市：