本发明专利技术涉及一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法，属于植物遗传转化的中间表达载体及其构建方法。该中间表达载体为pCAM-UPN，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示。本发明专利技术中的中间表达载体本身不含报告基因，己经通过限制性内切酶将报告基因GUS插入载体，构建得到植物表达载体pCAM-UGN。农杆菌介导法将pCAM-UGN转入水稻，PCR鉴定后得到GUS基因插入阳性植株，组织化学染色结果表明载体所带GUS基因在水稻中正常表达。
Intermediate expression vector suitable for single leaf plant transformation and construction method thereof
The invention relates to an intermediate expression vector suitable for the transformation of a single leaf plant and a construction method thereof. The intermediate expression vector is pCAM-UPN, and its nucleotide sequence is shown as SEQ? ID? No.4. The intermediate expression vector of the invention does not contain the report gene, and the GUS gene is inserted into the vector through the restriction endonuclease to construct the plant expression vector pCAM-UGN. PCAM-UGN was transferred into rice by Agrobacterium mediated method, and the GUS gene was inserted into the positive plants after PCR identification. The results of histochemical staining showed that the GUS gene was expressed in rice.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物遗传转化的中间表达载体及其构建方法。
技术介绍
我国粮食作物主要以小麦、水稻和玉米为主，而这三种作物都属于单子叶植物，其中小麦和水稻是重要口粮，玉米则是重要的粮食、饲料作物，同时也是制药、糖料、淀粉、油料、酒精工业等的主要原料。玉米的遗传转化研究具有广泛的应用和理论意义。目前应用的主流玉米遗传转化方法是基因枪转化法和农杆菌介导法，其中农杆菌转化方法因为有整合模式可能相对简单、外源基因表达传代可能相对稳定，操作简便、成本低，也可转移大片段DNA等优点而为玉米基因工程研究广泛利用。农杆菌介导法在双子叶植物上的遗传方法已经十分完善，由于玉米属单子叶植物，而单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，因此使用合适的植物表达载体尤为重要。一个基因的正常表达需要有表达组件及启动子和终止子的调控。在载体中往往需要有一个多克隆位点插入表达组件中，这样方便外源基因插入到表达载体中而完成一个目的基因的表达载体的构建。另一方面基因工程中常用的CaMV35S启动子也在双子叶植物中表达效果好，在单子叶植物中通常使用Ubiquitin启动子,这在玉米、水稻等单子叶植物中已经得到了验证。因此，针对玉米遗传转化应选用单子叶植物中表达效果好的启动子，构建成一种具有完整表达组件，可以插入目的基因，构建适用于除草剂筛选、无报告基因的中间表达载体，具有很大的实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供一种适合单子叶植物遗传转化的标准化中间表达载体。本专利技术所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体为pCAM-UPN，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4 所示。本专利技术提供的含有玉米Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列的中间表达载体，是将Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列插入双元载体的多克隆位点构建得到；其中所述的双元载体为PCAMBIA3300 ;其中所述的多克隆位点为人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述的玉米Ubiquitin启动子为玉米Ubiquitin启动子+内含子序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的终止子为NOS终止子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本专利技术提供的适合单子叶植物遗传转化的标准化中间表达载体pCAM-UPN，其多克隆位点有5个限制性内切酶酶切位点，启动子上游和终止子下游分别有I个限制性内切酶酶切位点。 本专利技术提供了所述中间表达载体构建的应用 ，构建植物表达载体PCAM-UGN，其核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。本专利技术提供了含有所述中间表达载体构建的植物表达载体pCAM-UGN的宿主细胞。(实施例中没有体现？已经有所表诉)本专利技术提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在基因转化中的应用。本专利技术提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在水稻和玉米遗传转化中的应用。本专利技术还提供了中间表达载体pCAM-UPN的构建方法，包括下列步骤:(I)克隆玉米Ubiquitin启动子Ub1-P,在启动子的上下游分别填加了 Hind III和BamH I位点，用于扩增Ub1-pro的引物为:Ubi_P HinFw:5 ' CCCAAGCTTGGG GCATGCCTGCAGTGCAGCGTGAC3 '和 Ub1-P BamRev:5 ' CGCGGATCCGCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAA3'，将扩增得到的 Ub1-P 与 pMD18_T simple 载体连接，得到载体 pMD18-UP ；(2)克隆Nos终止子Nos-T，在终止子的上下游分别填加了 Sac I和EcoR I位点，用于扩增 Nos-T 的引物为:NosSacFw:5 ' CGAGCTCGGAATTTCCCCGATCGTTCA 3 '和 NosEcoRRev:5/ CCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT3'，将扩增得到的 Nos-T 与 pMD18_T simple载体连接，得到载体PMD18-NT ；(3)人工合成多克隆位点，利用BamH I和Sac I位点插入pCAMBIA3300，得到载体pCAM-NP ；(4)将载体pMD18-UP和载体pCAM-NP的质粒分别用Hind III和BamH I双酶切，回收目的片段和载体片 段进行连接，得到载体pCAM-UP ；(5)将载体pMD18-NT和载体pCAM-UP的质粒分别用Sac I和EcoR I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到中间表达载体pCAM-UPN。本专利技术提供的中间表达载体pCAM-UPN具有完整的由启动子-多克隆位点_终止子序列构成的表达组件，它可以完整独立地驱动插入基因的表达。在该载体的多克隆位点有5个限制性内切酶酶切位点，可以将外源基因直接插入此多克隆位点即可构建出植物表达载体；在启动子上游和终止子下游分别有I个限制性内切酶酶切位点。本专利技术提供的pCAM-UPN含有Bar基因作为筛选标记，编码草胺磷乙酰转移酶，转基因材料用除草剂Basta进行筛选，避免了转基因后代用抗生素筛选引起争议；本专利技术中的中间表达载体本身不含报告基因，已经通过限制性内切酶将报告基因GUS插入载体，构建得到植物表达载体pCAM-UGN。利用基因枪轰击法将pCAM-UGN转入玉米愈伤组织，组织化学染色结果表明载体所带的⑶S基因在玉米中正常表达。农杆菌介导法将pCAM-UGN转入水稻，PCR鉴定后得到⑶S基因插入阳性植株，组织化学染色结果表明载体所带⑶S基因在水稻中正常表达。本专利技术提供的中间表达载体pCAM-UPN所构建的植物表达载体在玉米遗传转化中得到优于其他转化载体的结果。附图说明图1是本专利技术pCAM-UPN的载体图谱，载体骨架为pCAMBIA3300 ；图2是植物表达载体pCAM-UGN的载体图谱，载体骨架为pCAMBIA3300 ；图3是植物表达载体pCAM-UGN转化的玉米愈伤组织⑶S染色图片；图4A是植物表达载体pCAM-UGN在水稻中的表达，图中为用PCR检测TO代转基因水稻的PCR检测结果；+为质粒DNA对照，-为阴性对照，1-5为TO代转基因植株；图4B是植物表达载体pCAM-UGN在水稻中的表达，图中为TO代转化植株的⑶S染色结果，1-5为TO代转基因植株。具体实施例方式本专利技术所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体为pCAM-UPN，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4 所示。本专利技术提供的含有玉米Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列的中间表达载体，是将Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列插入双元载体的多克隆位点构建得到；其中所述的双元载体为PCAMBIA3300 ;其中所述的多克隆位点为人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述的玉米Ubiquitin启动子为玉米Ubiquitin启动子+内含子序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的终止子为NOS终止子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本专利技术提供的适合单子叶植物遗传转化的标准化中间表达载体pCAM-UPN，其多克隆位点有5个限制性内切酶酶切位点，启动子上游和终止子下游分别有I个限制性内切酶酶切位点。本专利技术提供了所述中间表达载体构建本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适合单子叶植物转化的中间表达载体，其核苷酸序列如SEQ?ID?No·4所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贺红霞，郝东云，刘相国，李晓辉，袁英，李楠，郭嘉，陈亮，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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