本发明专利技术属于蛋白质组学技术领域，具体为高丰度蛋白质去除的二维常规柱阵列式色谱分离系统，及运用该系统的分离方法。本发明专利技术仅需要一台多元液相泵、一个十通阀和两个六通阀用于进行连接和在线两维切换，提高了自动化程度和仪器的集成度。蛋白质样品经过第一维IE分离之后的馏分直接通过十通阀被依次切换转移到多通道的第二维常规反相柱柱头上进行富集，反相色谱柱直接对其在线脱盐和梯度洗脱，经过两维常规色谱分离，高丰度蛋白质可以在两维色谱图上得到精确定位，从而达到准确除去的目的。本发明专利技术方法可完成大体积进样，浓缩除盐、阵列式分离及高丰度蛋白质的定位与去除，十分适合蛋白质组学研究所需的高丰度蛋白质定位去除及高通量分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质组学
，具体涉及高丰度蛋白质去除的二维常规柱阵列式色谱分离系统，及运用该系统的分离方法。
技术介绍
随着人类基因组测序的完成，生命科学研究的重心也转移到了蛋白质组学的研究上。其主要问题集中在未知蛋白质的大规模鉴定及低丰度蛋白质的测定上。近年来，高效液相色谱技术作为高效的分离方法在蛋白质组学中发挥着愈来愈重要的作用。而与一维分离有限的分离能力相比，多维分离技术拥有更大的峰容量，且分离速度快、重现性好、自动化程度高，因此发展多维正交的液相色谱分离技术平台对于蛋白质组学的研究至关重要。当前，以Shotgun技术为代表的多维液相色谱技术路线在对未知蛋白质的大规模鉴定尤其是低丰度蛋白质鉴定方面有很强的优势。尽管多维色谱技术已经在蛋白质组学研究中体现出了其强大的分离分析能力，但是其分离模式还存在一定的缺陷。首先是多维色谱分离系统的通量有限，由于二维系统的第二维是单支反相色谱柱，所以不得不运用精确的仪器进行复杂而频繁的阀切换操作控制以实现串联型操作模式，且第二维的反相色谱柱所提供的分析通量有限，从而导致串联式操作模式的样品分析时间也大为延长。多维色谱分离模式的第二个缺陷是第 二维采样频率不能满足顺序型操作模式的需要。对于所有在线全二维或多维分离系统，均要求样品在两维间进行有效的转移才能保证各组分的分离效率不受后续分离的影响，尤其对后一维的分离速度有极高的要求。因此，发展高通量、高峰容量、高分辨率的新型蛋白质组学技术平台已成为当务之急。以阵列的形式实现第二维的分离是解决这些问题的明智选择。采用阵列并行式分离增大了系统的通量，同时也不存在采样频率的问题。目前已有二维阵列式毛细管液相色谱-基质辅助激光解析电离串级质谱(MALD1-MS-MS)系统用于蛋白质组学分析的研究，但对于复杂的样品来说，该毛细管阵列由于样品负载量比较少，对于其中高丰度蛋白质的去除和低丰度蛋白质的富集分离分析是不利的。因此发展常规柱阵列对于生物样品中的重要的低丰度蛋白质的分离鉴定更为有利，同时由于第二维的反相柱可直接作为第一维蛋白质馏分的预捕集柱，这样就省去了毛细管柱阵列所必须专门配置的预捕集柱，减少了系统的死体积,也节约了成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高丰度蛋白质去除的二维常规柱阵列式色谱分离系统。本专利技术的另一目的是提供用上述系统进行高丰度蛋白质去除的二维常规柱阵列式色谱分离系统的方法。本专利技术提供的高丰度蛋白质去除的二维常规柱阵列式色谱分离系统，由一个四元梯度泵(色谱泵)3，一个配有2 mL loop (定量环)的六通道进样阀1，一个液相六通阀8和一个十通道电动切换阀4 (简称十通阀，自动实现10通道依次切换)，一个8通道(液体从中间流入后分流成8通道流出)分流器7，8个Valco三通5，一根IE色谱柱2，8根反相色谱柱组成的阵列色谱柱6和一个紫外检测器组成；其中，配有2 mL loop的六通道进样阀I与单一 IE色谱柱2进口端、色谱泵3相连构成系统的第一维IE进样分离装置；IE色谱柱2的出口端直接与十通阀4的进口端相连,十通阀4的出口分别与每个Valco三通5的一个端口 13相连，实现第一维IE馏分到第二维阵列色谱柱6的转移；Valco三通5的另一个端口15直接与阵列反相色谱柱6的进口端相连，8个Valco三通5的第三个端口 14与8通道分流器7各个端口 11相连接；液相六通阀8与IE色谱柱2、8通道分流器7的端口 12相连；阵列色谱柱6的出口端、紫外检测器9与馏分收集器10依次相连构成第二维阵列反相分离部分。本专利技术中的8通道分流器7是一个直径为20mm并且在直径IOmm位置刻有不连续圆形槽的不锈钢块(带有内螺纹)，上面的圆形槽内均匀分布着10个直径0.5mm的微型圆孔，一个直径12_、厚度3_的聚酰亚胺垫片，一个12mm直径、1.5mm厚度的不锈钢垫片,一个直径20mm并且钻有微孔的不锈钢垫片和一套用于紧固聚酰亚胺垫片使系统压紧密封的螺栓。待测样品首先通过2 mL loop的六通道进样阀I进样到单一 IE色谱柱2上，用盐溶液进行洗脱，通过切换十通阀4被依次切换转移到第二维阵列反相色谱柱6的柱头上，阵列反相色谱柱6直接对其进行在线脱盐和富集，切换液相六通阀8使洗脱液通过分流器7对反相色谱柱6柱头 端的样品进行并行式洗脱分离；阵列反相色谱柱6通过色谱泵3进行色谱洗脱分离。因此，本专利技术分离系统由二维色谱构成，第一维色谱分离利用一根色谱柱，采用IE色谱柱；第二维色谱分离利用阵列色谱柱(可以是2-48根)，采用反相色谱柱。两分离系统通过十通阀、Valco三通相连接。色谱柱以及管路的连接方式将关系到系统的死体积大小，从而影响整个分离平台的分离效率。因此，本系统中尽量避免容易造成更大死体积的阀切换，发展简单、有效和死体积更小的连接方式。IE色谱柱的连接比较简单，其出口端直接与十通阀的进口端相连，以便依次将分步洗脱的馏分转移至各通道的反相柱上。十通阀的出口分别与每个Valco三通的其中一个端口相连以实现第一维IE馏分到第二维反相色谱柱的转移。第二维反相柱则分别直接接在Valco三通的端口上，来减小死体积。Valco三通的第三个端口和分流器各个出口相连接。进行第二维的梯度洗脱时，切换第二个六通阀使流动相洗脱液通过8通道分流器对8根反相柱端的样品进行并行式洗脱分离，省去了阵列式毛细管二维液相色谱平台所必须的预柱部分，而且通过Valco三通的两个端口分别连接反相柱和自制的分流器出口相连接，避免了复杂的阀切换，减少了系统的死体积，使操作更加简单方便。本专利技术中，IE色谱柱2的出口端直接与十通阀4的进口端相连。本专利技术中，Valco三通5的一个端口与十通阀4的出口相连，另一个端口直接与阵列反相色谱柱6的进口端相连，8个Valco三通5的第三个端口与分流器7各个出口相连接。本专利技术中，液相六通阀8与IE色谱柱2、分流器7相连。本专利技术中，第二维阵列反相色谱柱可以是8根色谱柱。本专利技术中，洗脱液通过分流器7对反相色谱柱6柱头端的样品进行并行式洗脱分离。本专利技术中，单一 IE色谱柱2馏分是通过切换十通阀4被依次切换转移到第二维阵列反相色谱柱6的柱头上。本专利技术获得了如下良好效果: 本系统采用常规色谱柱分离样品可以增大上样量，从而通过去除高丰度蛋白质的掩蔽实现提高中低丰度蛋白质的检测灵敏度，而并行阵列式色谱柱又可以提高样品的分离通量，多通道式的并行接口使系统在第二维8根反相色谱柱上实现并行式洗脱，使样品分析时间缩短8倍。系 统可快速完成进样，浓缩除盐、分离分析，从而可以实现真正的蛋白质组学研究所需的高通量分析。单根IE色谱柱进行第一维的分离，8根反相色谱柱同时作为第一维馏分的预富集柱和分析柱对其进行并行式富集和分离。在此技术平台中，由于每一步IE色谱柱的盐溶液洗脱不伴有相应的反相色谱柱的乙腈梯度洗脱，从而在第二维分离过程中不存在多次的采样-洗脱循环。反相色谱柱直接对其进行在线脱盐和富集，省去了省去毛细管柱阵列所必须专门配置的预捕集柱，不仅减少了系统的死体积，也降低了成本。采用8个馏分同时并行洗脱的方式使整个系统的分离时间缩短至一维色谱的1/8，通量大为增加。在非阵列式在线二维液相体系中，提高第二维的分离速度往往是以牺牲柱效为代价的，而此阵列式分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于高丰度蛋白质去除的二维常规柱阵列式色谱分离系统，其特征在于由一个四元梯度色谱泵（3），一个配有2?mL?loop的六通道进样阀（1），一个液相六通阀（8），一个十通道电动切换阀（4），一个8通道分流器（7），8个Valco三通（5），一根IE色谱柱（2），8根常规反相色谱柱组成的阵列色谱柱（6）和一个紫外检测器组成；其中，配有2?mL?loop的六通道进样阀（1）与单一的IE色谱柱（2）进口端、色谱泵（3）相连构成系统的第一维IE进样分离装置；IE色谱柱（2）的出口端直接与十通阀（4）的进口端相连，十通阀（4）的出口分别与每个Valco三通（5）的一个端口（13）相连，实现第一维IE馏分到第二维阵列色谱柱（6）的转移；Valco三通（5）的另一个端口（15）直接与阵列RPLC色谱柱（6）的进口端相连，8个Valco三通（5）的第三个端口（14）与8通道分流器（7）各个端口（11）相连接；液相六通阀（8）与IE色谱柱（2）、8通道分流器（7）的端口（12）相连；阵列色谱柱（6）的出口端、紫外检测器（9）与馏分收集器（10）依次相连构成第二维阵列RPLC分离部分。
【技术特征摘要】
1.一种用于高丰度蛋白质去除的二维常规柱阵列式色谱分离系统，其特征在于由一个四元梯度色谱泵(3)，一个配有2 mL loop的六通道进样阀(1)，一个液相六通阀(8)，一个十通道电动切换阀(4)，一个8通道分流器(7)，8个Valco三通(5)，一根色谱柱(2)，8根常规反相色谱柱组成的阵列色谱柱(6)和一个紫外检测器组成；其中，配有2 mL loop的六通道进样阀(I)与单一的IE色谱柱(2)进口端、色谱泵(3)相连构成系统的第一维IE进样分离装置；IE色谱柱(2)的出口端直接与十通阀(4)的进口端相连，十通阀(4)的出口分别与每个Valco三通(5)的一个端口(13)相连，实现第一维IE馏分到第二维阵列色谱柱(6 )的转移；ValCo三通(5 )的另一个端口( 15 )直接与阵列RPLC色谱柱(6 )的进口端相连，8个Valco...
【专利技术属性】
技术研发人员：张祥民，高明霞，洪广峰，黄志，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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