本发明专利技术公开了一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法。该方法先以溶剂提取内源性油菜素甾醇，然后以硼亲和材料为萃取介质对上一步所得溶液进一步除杂，进而实现内源性油菜素甾醇的样品前处理。该方法简单、快速、省溶剂、易操作。此外，方法在去除植物提取液内源性杂质方面表现出高选择性，可实现低含量的内源性油菜素甾醇的富集纯化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物样品中内源性油菜素留醇的样品前处理方法，属于分析化学领域。
技术介绍
油菜素甾醇(brassinosteroids, BRs)是一类多轻基化的甾醇类化合物,在植物体内含量极低，但调控着植物的一系列生理学和代谢过程。近年来，关于油菜素留醇的生理学机能，例如BRs的生物合成，降解以及代谢路径的研究收到广泛关注。但由于植物提取液中基质复杂且油菜素留醇含量极低，这些研究的开展受到一定限制。因此，建立高效的样品前处理方法并结合灵敏的检测手段是内源性BRs检测的关键。目前已报道的植物中油菜素甾醇的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、固相微萃取、磁固相萃取和液相色谱纯化方法等。这些方法多数要求几十克鲜重植物组织，如此大的样品量对于部分珍贵的样品难以实现，同时也给前处理过程带来溶剂消耗大和成本高等问题。此外，上述前处理方法仅仅通过BR和杂质的疏水性差异实现除杂，会不可避免地造成杂质与BRs的共洗脱，必然为后续的液相分离带来负担，从而降低BRs的质谱离子化效率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是对现有的油菜素留醇前处理方法进行改进，提供一种高选择性且简便快速的植物样品前处理方法，并实现内源性油菜素留醇的样品前处理。本专利技术解决上述问题而采用的技术方案是:，包括以下步骤:1-1准确称量植物样品后将其置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，加入同位素内标油菜素内酯和油菜素留酮，然后加入溶剂提取，静置，离心取上清液，得到未除杂的样品溶液；2-1去除上一步得到的样品溶液中的溶剂，以缓冲溶液溶解样品溶液，用活化后的硼亲和材料萃取样品溶液，清洗硼亲和材料，再以解吸液解吸硼亲和材料上的油菜素甾醇，收集解吸液，去除解吸液中的有机溶剂，进而实现内源性油菜素留醇的样品前处理。所述步骤2-1中，硼亲和材料依次以能够与水互溶的有机溶剂和缓冲溶液活化。本专利技术步骤1-1与2-1之间插入有下列步骤1-2:1-2对步骤1-1得到的样品溶液除水；以活化后的材料萃取步骤1-2除水后的样品溶液，解吸、收集并合并上样流出液和解吸液，得到初步除杂后的样品溶液。样品中的水分会对后续除杂过程产生不利影响，因此，除水步骤很重要。本专利技术所指的除水过程包括化学除水法和物理除水法。化学除水法，其特征在于，使用化学试剂消耗体系内的水分；物理除水法，其特征在于使用物理手段将体系内的水分挥干，包括冻干，氮气吹干等方法。植物组织提取溶剂的作用是:在有效地提取出分析物的前提下，尽可能少地提取杂质等干扰物。所述步骤1-1中提取所用的溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸中的一种或几种。所述步骤2-1中的硼亲和材料为含有硼酸基团的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱中的一种。所述的初步除杂是指初步除去提取液中含有的大量色素、脂质和亲水杂质。因此，本专利技术步骤1-2中所用的材料是采用由碳材料、亲水材料、疏水材料通过C31, Cf或者C33方式组合以化学或物理方式构建的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱均可以达到初步除杂的目的。硼亲和色谱是选择性捕获分离含顺式羟基化合物的有效手段，已被成功用于糖蛋白、RNA和糖类的富集分离。在碱性环境中，硼酸可与顺式二醇形成稳定的五元或六元环状硼酸酯，在酸性条件下，顺式二醇类物质又能通过开环而被释放。BRs在C2，C3和C22，C23位上的两对顺式羟基使得油菜素留醇十分适合硼亲和萃取。本专利技术所述的硼亲和除杂是指，由含硼酸基团的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱实现对油菜素甾醇的萃取。检测油菜素甾醇的仪器是指，液相色谱-光学检测器、液相色谱-质谱仪联用、毛细管电泳-光学检测器联用，或者毛细管电泳-质谱仪联用。本专利技术方法简单、快速、省溶剂、易操作。此外，方法在去除植物提取液内源性杂质方面表现出高选择性，可实现低含量的内源性油菜素留醇的富集纯化。附图说明图1为本专利技术方法与文献报道方法的总离子流对比图，其中，A是植物样品以文献法所得的总离子流图，B是以本专利技术法处理后的总离子流色谱图，C是标准样品以硼亲和萃取法处理后的总离子流色谱图。图2为本专利技术法检测到的内源性油菜素甾醇的多反应监控色谱图。其中A是水稻裕泰A叶样品；B是水稻裕泰B叶样品；C是油菜叶样品；D1 D4是油菜花的花苞样品；E1 E3 是油菜花的样品。I 为 28-norbrassinolide, 2 为 28_norcastasterone, 3 为brassinolide, 4 为 castasterone。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术的内容做详细说明。实施例1准确称取Ig植物组织，液氮研磨至粉末状，转移至IOmL离心管中，加入同位素内标油菜素内酯和油菜素甾酮各2ng，放置片刻后，加入5mL乙腈混合均匀。放入_18°C的冰箱内提取12小时。离心取上清液，向上清液中加入0.5克氯化钠促使溶液分层，弃去水相。再加入0.5克无水硫酸镁除去剩余水分。离心取除水后的上清液，弃去不溶物。将上清液通过预先活化的石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基键合硅胶双层固相萃取，以甲醇/乙腈(l/l，v/v，2mL)解吸；收集上样流出液和解吸液并吹干。以缓冲溶液(磷酸缓冲溶液，20mM，pH9.0, ImL)溶解吹干的样品残渣，将该溶液通过预先活化的硼亲和固相微萃取整体柱，以缓冲溶液(磷酸缓冲溶液，20mM，pH9.0, ImL)清洗整体柱，最后以含3%双氧水的解吸液(H2O/乙腈，l/9，v/v，ImL)解吸，收集解吸液并吹干其中的有机溶剂。最终，将样品溶液定容至100微升，其中80微升进入高效液相色谱-电喷雾-三重四级杆串联质谱分析。将上述方法与文献报道方法的总离子流对比，如图1所示。与文献法相比，本方法可大大降低样品的基质，其基质与标准品类似，表明本专利技术具有良好的选择性除杂效果。本专利技术法检测到的几种内源性油菜素甾醇:28-降油菜素内酯(28-norbrassinolide), 28-降油菜素甾丽(28-norcastasterone)，油菜素内酷(brassinolide)，油菜素留丽(castasterone)的多反应监控色谱图如图2所示。五种植物样品中内源性油菜素留醇检测结果如表I所示。表1.五种实际样品中内源性油菜素甾醇的含量权利要求1.一种植物样品中内源性油菜素留醇的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤: 1-1准确称量植物样品后将其置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，加入同位素内标油菜素内酯和油菜素留酮，然后加入溶剂提取，静置，离心取上清液，得到未除杂的样品溶液； 2-1去除上一步得到的样品溶液中的溶剂，以缓冲溶液溶解样品溶液，用活化后的硼亲和材料萃取样品溶液，清洗硼亲和材料，再以解吸液解吸硼亲和材料上的油菜素留醇，收集解吸液，去除解吸液中的有机溶剂，进而实现内源性油菜素留醇的样品前处理。2.根据权利要求1所述的一种植物样品中内源性油菜素留醇的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤2-1中，硼亲和材料依次以能够与水互溶的有机溶剂和缓冲溶液活化。3.根据权利要求1所述的一种植物样品中内源性油菜素留醇的样品前处理方法，其特征在于，步骤1-1与2-1之间插入有下列步骤1-2: 1-2对步骤本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：1?1准确称量植物样品后将其置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，加入同位素内标[2H3]油菜素内酯和[2H3]油菜素甾酮，然后加入溶剂提取，静置，离心取上清液，得到未除杂的样品溶液；2?1去除上一步得到的样品溶液中的溶剂，以缓冲溶液溶解样品溶液，用活化后的硼亲和材料萃取样品溶液，清洗硼亲和材料，再以解吸液解吸硼亲和材料上的油菜素甾醇，收集解吸液，去除解吸液中的有机溶剂，进而实现内源性油菜素甾醇的样品前处理。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯钰锜，丁俊，毛利菁，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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