用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及其检测方法，本发明专利技术试剂由鼠抗人CK8/18免疫组化单克隆抗体20%、即用型钙调节蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型细胞角蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型P63蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、肌动蛋白HHF-35鼠抗人单克隆抗体20%组成，在标记乳腺肌上皮细胞时，具有较强的特异性和敏感性，可以分别对同一靶细胞内不同的靶抗原进行识别，使细胞核、细胞膜和细胞质同步着色，明显增加了肌上皮细胞的反应性和敏感性，更能客观地显示出乳腺腺泡和导管的基本结构，对乳腺病变的诊断起到很好的辅助作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种免疫组化试剂，尤其是一种。
技术介绍
乳腺组织常含有多种抗原成分，表达于不同种类细胞的细胞膜、细胞质和细胞核不同部位。乳腺疾病病理诊断要显示肌上皮、腺上皮组织的不同抗原，往往需要用多种抗体分别在多张切片上染色标记，若肌上皮连续存在则无浸润癌，若肌上皮阴性反应则为乳腺浸润癌(盲管腺病除外)。单种抗体显示，导管原位癌肌上皮细胞胞呈跳跃性阳性，肌上皮不连续。若在一张切片上同时显示多种组织抗原，往往需要在一张切片上采用多次标记反复标记，5种抗体就要5次染色，方法烦琐，染色时间长，且在一张切片上反复操作容易引起组织脱落，从方法学角度也费时费力。
技术实现思路
本专利技术的技术任务时针对以上现有技术的不足而提供一种。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是:一种，该试剂由以下重量份的抗体组成:鼠抗人CK8/18免疫组化单克隆抗体20%、即用型钙调节蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型细胞角蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型P63蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、肌动蛋白HHF-35鼠抗人单克隆抗体20%,其制作方法是分别等量吸取上述各组分抗体，然后进行混合，在旋涡混合器上旋转混匀或者吸管吹打混匀即可，并置4°C冰箱内保存备用。用于鉴别乳腺肌上皮病变的检测方法，包括以下步骤:步骤一、把采集的乳腺肌上皮组织经过脱水、透明及浸蜡后，进行石蜡包埋后，进行切片，厚度为3-5um，对疑有病变的组织选作免疫标记，在温度为58°C _60°C下，放到恒温箱内烤切片2-3小时，切片上的石蜡经过脱蜡、水化后，用TBS液冲洗切片3次，每次3分钟；步骤二、将切片经内源性过氧化物酶阻断，用浓度为3%的新鲜配制的过氧化氢孵育切片5分钟，然后用蒸馏水冲洗切片2次，每次3分钟； 步骤三、用EDTA修复液对切片进行抗原修复； 步骤四、向切片加非免疫动物血清，室温下孵育切片10分钟； 步骤五、除去切片上的非免疫动物血清，向切片加多重染色试剂，在17°C—33°C温度下孵育切片30-60分钟； 步骤六、加使MACH 2 Double Stain酶标二抗试剂，室温孵育切片30分钟，用TBS液冲洗切片3次，每次3分钟，再用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟； 步骤七、除去切片上的蒸馏水后，加AP-red显色剂室温孵育切片10-20分钟，用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟，在显微镜下观察，掌握染色时间，阳性信号为红色，观察完成后，用TBS液冲洗切片3次，每次3分钟，再用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟，然后采用pH值为2.0，浓度为0.05% HCl室温孵育切片30分钟，用TBS液冲洗切片2次，每次3分钟； 步骤八、加DAB显色剂室温孵育切片5分钟后，用蒸馏水冲洗切片2次，每次3分钟，在显微镜下观察，掌握染色时间，阳性信号为黄色或者棕黄色，观察完毕后，用蒸馏水冲洗切片3次，每次3分钟； 步骤九、除去切片上的蒸馏水，加苏木精浅染30-60秒后，用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟； 步骤十、除去切片上的蒸馏水，在切片未干时，直接滴加水性封片剂封片，60°C烘干15-30分钟，水性封片剂干燥后，待自然冷却，再用中性树胶封片即可。在上述步骤一中所述石蜡的熔点小于60°C。在上述步骤三中所述EDTA修复液为在100°C温度下煮沸20分钟，其pH为8.0。在上述步骤七中所述AP-red显色剂为现用现配。本专利技术多重染色试剂在标记乳腺肌上皮细胞时，具有较强的特异性和敏感性。可以分别对同一靶细胞内不同的靶抗原进行识别，使细胞核、细胞膜和细胞质同步着色，明显增加了肌上皮细胞的反应性和敏感性，更能客观地显示出乳腺腺泡和导管的基本结构，对乳腺病变的诊断起到很好的辅助作用。通过实验观察，我们发现本专利技术多重染色试剂用于免疫组织化学标记具有抗体优势互补的效应，两种抗体能分别与相同细胞的不同靶抗原起反应，共同识别靶细胞，提示该技术有协同检测肿瘤组织来源的潜力，尤其有助于肿瘤病理诊断。该方法目前只适用于抗原不在相同位置的双标记，尚不适用于两抗原可能在同一定位的检测。本专利技术产生技术效果如下: 1、能同步标记不同组织的两种靶细胞，又能标记相同靶细胞中不同的靶抗原； 2、避免了单标记间断性、跳跃性，该标记法使得肌上皮连续标记，易于检出和确认小灶性微浸润癌，提高了诊断的可重复率和准确率； 3、尤其是在穿刺活检小标本中，一次单张切片多种染色，可以减少相当一部分漏诊或因诊断结果不确定而导致患者不必要的重复穿刺活检； 4、克服了单标记试剂染色的不连续性和跳跃性，使得单标记时肌上皮细胞貌似缺如或结构断裂区域显示为肌上皮结构连续，其反应强度也明显较仅单标记显著，区别于乳腺浸润性导管癌无阳性反应，使得肌上皮与腺上皮分布一目了然。5、单张切片，同时着不同颜色，提高了色彩对比的清晰度； 6、新的封片方法不同于以往的湿封法，可长久保色，不褪色； 7、简便、经济、实用，既适用于课题研究实验，又适用于临床病理诊断，在联合寻找肿瘤组织来源上具有很大的潜力。具体实施例方式一种用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色免疫组化试剂，该免疫组化试剂由以下重量份的抗体组成:鼠抗人CK8/18免疫组化单克隆抗体20%、即用型钙调节蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型细胞角蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型P63蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、肌动蛋白HHF-35鼠抗人单克隆抗体20%，其制作方法是分别等量吸取上述各组分抗体，然后进行混合，在旋涡混合器上旋转混匀或者吸管吹打混匀即可，并置4°C冰箱内保存备用。在进行多重染色之前首先分别做单独染色的预实验，其实验条件与多重染色时的条件相同。该专利技术多重染色试剂免疫组织化学染色采用以聚合物链接的辣根过氧化物酶HPR检测系统，具体方法为: 步骤一、把采集的乳腺肌上皮组织经过脱水、透明及浸蜡后，进行低熔点的石蜡(熔点〈60° C)包埋后，进行切片，厚度为3-5um，对疑有病变的组织选作免疫标记，在温度为580C _60°C下，放到恒温箱内烤切片2-3小时，切片上的石蜡经过脱蜡、水化后，用TBS液冲洗切片3次，每次3分钟； 步骤二、将切片经内源性过氧化物酶阻断，用浓度为3%的新鲜配制的过氧化氢孵育切片5分钟，然后用蒸馏水冲洗切片2次，每次3分钟； 步骤三、用EDTA修复液对切片进行抗原修复，其EDTA修复液为在100°C温度下煮沸20分钟，其pH为8.0 ; 步骤四、向切片加非免疫动物血清，室温下孵育切片10分钟； 步骤五、除去切片上的非免疫动物血清，向切片加多重染色试剂，在17°C—33°C温度下孵育切片30-60分钟或者放在4°C冰箱内孵育过夜，在潮湿密封闭的环境中进行，目的是避免多重染色试剂中抗体水分蒸发造成抗体的浓缩或干燥； 步骤六、加使MACH 2 Double Stain酶标二抗试剂，其MACH 2 Double Stain选用美国Biocare Medical公司生产的，室温孵育切片30分钟，用TBS液冲洗切片3次，每次3分钟，再用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟； 步骤七、除去切片上的蒸馏水后，加AP-red显色剂室温孵育切片10-20分钟，用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟，在显微镜下观察，根据红色的发展掌握染色时间，阳性信号为红色，观察完成后，用TBS液冲洗切片3次，每次3本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂，其特征在于该多重染色试剂由以下重量份的抗体组成：鼠抗人CK8/18?免疫组化单克隆抗体20%、即用型钙调节蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型细胞角蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型P63蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、肌动蛋白HHF?35鼠抗人单克隆抗体20%，其制作方法是分别等量吸取上述各组分抗体，然后进行混合，在旋涡混合器上旋转混匀或者吸管吹打混匀即可，并置4℃冰箱内保存备用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚平，
申请(专利权)人：王刚平，
类型：发明
国别省市：