本发明专利技术公开了一种用于焦磷酸核酸测序系统的微量加样方法，包括以下步骤：步骤a，通过一加样元件插入任一dNTP试剂中使得所述加样元件外周附着所述dNTP试剂；步骤b，将附着所述dNTP试剂的加样元件插入测序反应液中，再使所述加样元件离开所述测序反应液；其中：所述加样元件包括一实心加样针及其驱动装置。本发明专利技术采用一结构简单的加样元件即可实现dNTP试剂的微量给样，摒弃了传动的中空针管抽喷式的给样方式，仅通过所述加样元件的加样针与液体间的吸附力及其在不同液体中的移动速度差异的控制即可实现微量取样加样，加样重复精度大于95%，且最小加样量可达0.1μL。
Micro sample adding method and device and application for pyrosequencing system
The present invention discloses a kind of method for trace pyrophosphate nucleic acid sequencing system, which comprises the following steps: step a, insert any dNTP reagent so that the sample element peripheral attachment of the dNTP reagent by a sample adding element; step B, the attachment of the dNTP reagent and sample insertion sequencing in the reaction solution, and then the sample components from the sequencing reaction liquid; wherein the sample element comprises a solid needle and its driving device. The invention adopts a simple structure and can be realized like element dNTP reagent to trace, to abandon the hollow pumping injection needle drive to the kind of way, only through the adsorption of sample element adding sample needle and liquid control between can and its moving speed in different liquids between micro sampling and sampling, sample repeat accuracy is greater than 95%, and the minimum sample size of 0.1 L.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生化检测技术中的微量加样方法，具体说，是涉及一种用于焦磷酸核酸测序系统的微量加样方法及其装置和应用。
技术介绍
一、焦磷酸测序概况焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是于1987年发展起来的、基于DNA合成过程中释放的焦磷酸(PPi)检测的测序技术，焦磷酸测序反应在一系列酶的催化作用下的，其过程中会产生与脱氧三磷酸核苷(dNTP)的聚合数目成比例的可见光，通过对可见光检测可达到测定DNA序列的目的。焦磷酸测序有两种实现方法:液相焦磷酸测序法(LiquidPhase Pyrosequencing)和固相焦憐酸测序法(Solid Phase Pyrosequencing)。液相焦磷酸测序是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，其原理是:引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATPs ii Lfurylase)、突光素酶(Iuciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)协同作用下,将引物DNA上每一个dNTP的聚合与荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的(马永平等，焦磷酸测序技术及其在分子生物学领域的应用.国外医学分子生物学分册2003，25 (2):115-117)。液相焦磷酸测序的反应体系由反应底物、待测单链、特异性测序引物和酶构成，反应底物为5’-磷酰硫酸(APS)和荧光素(Iuciferin)。液相焦磷酸测序反应过程是一个向反应体系中轮流加入4种dNTP参与反应的`过程，每轮反应只有一种dNTP参加。如果加入的dNTP刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则其在DNA聚合酶的作用下被添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi);在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi和APS结合形成ATP ;在荧光素酶的作用下，生成的ATP又和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。如果加入的这种dNTP刚好能好和DNA模板的下面连续n个相同碱基匹配，根据反应方程式可知，释放出的可见光强度应是只有I个碱基匹配时的n倍，也即反应过程中释放的光强度与相匹配的碱基数目成比例关系。如果加入的dNTP和DNA模板的下一个碱基不匹配，则上述反应不会发生，也没有可见光的释放。未参加反应的dNTP和ATP在核苷酸降解酶Apyrase的作用下降解。每轮反应释放出的可见光通过微弱光检测装置转化，再被处理为数字信号，经PC软件处理即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低应和相匹配的碱基数目成比例关系。待上一轮反应结束后，加入另一种dNTP，重复进行上述反应。最终可根据获得的光强度峰值图即可读取的待测DNA序列信息。需要注意的是:dATP的降解产物脱氧单磷酸鸟苷(dAMP)是荧光素酶的抑制剂，随着反应的进行，其浓度会越来越高，会阻碍焦磷酸测序化学发光反应的继续进行。这也是焦磷酸测序法测序长度较短(通常为20bp 30bp)的主要原因(Shendure J,et al.Advancedsequencing technologies:Methods and goals, Nat.Rev Genet.,2004,5(5):335-44)。固相焦磷酸测序是由3种酶催化的化学发光反应，与液相焦磷酸测序相比，没有三磷酸腺苷双磷酸酶参加。固相焦磷酸测序反应过程如下:结合了引物的DNA模板被固定于支撑物上并在反应过程中保持位置不变；加入一种dNTP后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和荧光素酶协同作用下发生反应，除了没有降解反应发生，其他反应与液相焦磷酸测序完全相同；在加入下一种dNTP前有一个冲洗步骤(washing step)将上轮反应残留物完全冲走，不会有抑制性产物的堆积。通常情况下，入们所说的焦磷酸测序法指的是液相焦磷酸测序法，因为其四酶反应系统使得焦磷酸测序可以很方便地在单管中实现。 Ronaghi等利用dATP a S替代dATP提高焦磷酸测序的信噪比(Ronaghi M.etal.Real-time DNA sequencing using detection of PPi release ；Anal.Biochem,1996,242 (I): 84-89)。因为dATP a S可以比dATP被DNA聚合酶更有效地利用，更有利于阅读富含T的区域。dATP a S是两种异构体Sp-dATP a S和Rp-dATP a S的混合物，聚合酶只能利用Sp-dATP α S。为了得到最佳反应效率，必需在反应体系中保持最佳浓度的Sp-dATP α S，与此同时Rp — dATP a S的浓度也在增加。dATP a S被Apyrase降解后仍会产生荧光素酶的抑制物，因此dATP a S的加入并没有提高读序能力。Gharizadeh等人对此进行了改进,他们在反应中只加入纯的Sp-dATP aS,而不加入无用的Rp-dATP a S，提高了反应的效率，大大降低了抑制产物的浓度，使得荧光素酶能够维持较长时间的活性，使焦磷酸测序法的测序长度增加到50bp lOObp，测序长度的增加也使得焦磷酸测序技术有了许多新的应用(Gharizadeh B.et al., Long-readpyrosequencing using pure2’ -deoxyadenosine-5J -0’ - (1-thiotriphosphate)Sp-1somer ；Anal Binchem,2002.301:82-90)。在2000年举办的第十二届基因组测序和分析会议(12th International GenomeSequencing and Analysis Conference)上，Ronaghi 等人提出了一种移除抑制产物、减小稀释效应的方法，将测序长度增加到200bp。与sanger双脱氧链终止测序法相比，焦磷酸测序法具有快速、准确、经济、实时检测的特点；它不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有很高的可重复性；能实现高度的并行性和高度的自动化。二、焦磷酸测序技术的应用进展I在单核苷酸多态性研究中的应用单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)是近年来出现的第三代遗传标记，它指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少的一种在群体的频率不小于1%。SNPs是生物的基因组中最为常见的遗传多态型，它可以在任何 个待研究基因的内部或附近提供一系列标记；而正是这种基因组中的多态性，即基因组序列的差异构成了不同个体与群体对疾病的易感性、对药物与环境因子不同反应的遗传学基础。SNP的研究主要包括两个方面:一是SNP数据库的构建，主要是发现特定种类生物基因组的全部或部分SNP。二是 SNP功能研究，发现SNP只是SNP研究的第一步，SNP功能的研究才是SNP研究的目的。Sanger测序技术已成为大规模、准确、快速发现SNP的主流技术。而对数据库中已有SNP进行序列验证分析和频率分析，擅长短序列测序和验证的焦磷酸测序技术是很好的选择，采用焦磷酸测序技术进行SNP研究，更可以节约时间并降低消耗。Nordfors等分别采用Taqman突光本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于焦磷酸核酸测序系统的微量加样方法，其特征在于：包括以下了步骤：步骤a，通过一加样元件插入任一一种dNTP试剂使得所述加样元件外周附着所述dNTP试剂；步骤b，将附着所述dNTP试剂的加样元件插入测序反应液中，再使所述加样元件离开所述测序反应液；其中：所述加样元件包括一实心加样针及其驱动装置。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓刚，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：上海聚阵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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