本发明专利技术涉及测定混合物中第一抗原的抗原含量的某些方法，该混合物包含两种或更多种抗原。本发明专利技术还涉及联合疫苗中抗原的效价测试。该方法允许测定在额外包含能够与抗原结合的抗体的混合物中的抗原含量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及测定混合物中第一抗原的抗原含量的特定方法，该混合物包含两种或更多种抗原。本专利技术还涉及针对联合疫苗中抗原的效价测试(potency test)。
技术介绍
含有从不同病原生物衍生的保护性抗原的联合的疫苗对于疫苗接受者和生产者都具有多重明显的益处。尤其是联合或者多价疫苗，通过减少所需的注射次数和可能地护理次数，提供增加的施用容易性和对病人的更大舒适性及便利性。由于节省了组合散装材料(bulk material)的加工、容器、包装、分配以及注射设备,它们对于制造和施用也是更加经济的。在人类健康领域，联合疫苗常被用于做婴儿免疫的情形。联合疫苗如带有或不带有灭活脊髓灰质炎的DTP (白喉，破伤风和百日咳)、以及MMR(麻疹，流行性腮腺炎和风疹)已经应用多年，并且近些年新的抗原已加入该联合中。在动物健康领域，联合疫苗也被普遍应用。尤其是家禽、猪、反刍动物和宠物的疫苗往往是基于多种抗原的联合。这些疫苗的例子是针对对犬的犬瘟热、肝炎、II型副流感、细小病毒、钩端螺旋体和狂犬病毒，对家畜的轮状病毒、冠状病毒和大肠杆菌，对家禽的新城疫病毒、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、肿头综合征和产蛋下降综合征的联合疫苗。一批疫苗只有在发出许可证或上市授权后才可准予销售。此外，该获得授权的疫苗批次的每个后续批次必须遵守所涉及的一州或多州的规定正式准许。这样的准许可在规定的批次测试令人满意地完成后基于制造商的授权而允许。因此，为了保证每一批次及各个批次的疫苗会具有其意图的效果，必须执行质量恒定的制造过程，并且效价测试的应用是该过程的重要部分。目前，不同的测试方法被用于测定疫苗效价，如生理化学性质、抗原性、免疫原性、感染性以及抗感染或疾病的保护性的测定。它们的应用取决于疫苗抗原的性质和测试的目的。在活疫苗中，效价可以基于疫苗中存在的生物数目(滴度)。在灭活疫苗的情况下，通常通过测定靶动物物种或者其他物种如小鼠或大鼠中的免疫反应来测定效价。可选地，灭活疫苗的效价可以基于其抗原性，通过测定存在的抗原的数量(抗原量)，应用使用特异性抗体的免疫测定，如ELISA(酶联免疫吸附测定)进行。虽然，对联合疫苗中个别抗原组分的药典需求提供了起点来建立相关及有效的效价测试，但是在更复杂的联合疫苗中各种组分间相互作用导致的问题是公知的(Vidor，J.Comp.Path.137,62-66, 2007 ;Sesardic et al., Biologicals 27,177-181,1999)。每个联合疫苗由活性组分赋形剂和残余物质的独特聚集体组成。这些物质中的任何都可干扰特定活性组分效价的精确测定。对于抗原的抗原性或免疫原性的干扰可能由存在的其它抗原的性质、其质量、数量或比例、佐剂、防腐剂、稳定剂、PH值、疫苗的等渗性等引起。本专利技术人现在已经鉴定了在分别混合包含抗原和其他组分的组合物之后，联合疫苗中特定抗原和其他组分间意想不到的相互作用。
技术实现思路
令人惊讶地，发现在含有第一抗原的组合物和含有第二抗原的组合物的混合物中，第一抗原的抗原性受到结合该第一抗原从而形成抗原-抗体复合物的抗体的存在的影响，并且这些抗体可以来自含有第二抗原的组合物。实施例1和2显示下列问题:在含有不同抗原的组合物的混合物中，抗原可被无效地检测，以及在这种混合物中可形成抗原-抗体复合物，其中抗体来自与含待测抗原的组合物不同的组合物。此外，发现抗原-抗体复合物的解离导致第一抗原的抗原性恢复。这些干扰抗体的存在可由在衍生自动物的血清的存在下体外培养特定微生物(第二抗原)的必要性以及从其收获血清的这些动物被诱发针对第一抗原的抗体的微生物感染来解释。混合物中这些抗体对第一抗原的抗原性的干扰影响免疫测定中第一抗原的定量，例如效价测试用于准许疫苗批次进行销售。简言之，本专利技术涉及测定至少包含第一抗原的组合物和包含第二抗原的组合物的混合物中第一抗原的抗原含量的方法。更具体地，本专利技术涉及这样的方法，其中包含第二抗原的组合物还包含能够结合第一抗原的抗体。本专利技术还涉及测定混合物中第一抗原的抗原含量的方法，所述混合物为至少包含第一抗原的组合物、以及含有(i)第二抗原和(ii)能够结合第一抗原的抗体的组合物的混合物，该方法包括如下步骤， A解离混合物中第一抗原及抗体间形成的抗原-抗体复合物，和 B通过免疫测定来测定第一抗原的抗原含量。免疫测定的设计可以变化，并且可以与本领域中通常用于定量样品中病毒或细菌抗原的那些免疫测定类似。例如，测定可以基于竞争性或者直接反应。此外，方案可以使用固体载体，如微量滴定板。抗原的检测可以涉及对第一抗原具有特异性的(直接地或间接地)标记抗体(检测抗体)的应用，并且标记可以是酶分子、荧光分子、化学发光分子、放射性分子或者染料分子。检测抗体可以是单特异性的多克隆抗体或者单克隆抗体。用于根据本专利技术方法的典型免疫测定在标准的实验室教科书中描述，如Antibodies:A LaboratoryManual, eds.: Harr low and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988。这些测试的实例是凝集测定、ELISA以及AlphaLISA。抗原可以是任意类型的抗原，但是优选来自对人或动物有病原性的微生物。尤其地，抗原来自病毒或细菌。一般地，术语抗原是指含有至少一个表位的物质组合物，当施用给人或动物时，所述表位能够诱导、刺激或者增强免疫反应。抗原可以是完整的病原体，优选灭活或减毒形式，病原体的提取物或者病原体的免疫原性蛋白。更优选地，抗原为在体外培养的细胞中表达及从所述细胞回收的免疫原性蛋白。特别地，第一抗原可以是病原体的抗原，该抗原在特定动物物种中诱导(通过自然暴露或者疫苗接种)高度普遍的病原体特异性抗体。例如，该病原体可以选自猪II型环状病毒(PCV-2)，猪红斑丹毒丝菌(Erysipeiothrix rhusiopathiae),蓝舌病毒,边缘病病毒，犬新孢子虫，火鸡冠状病毒以及手足口病病毒。特别地，第二抗原可以是病原体的抗原，该病原体的体外培养取决于来自特定动物物种的血清。例如,这种病原体可以选自支原体属，劳森氏菌(Lawsonia),利士曼原虫属，巴贝虫属，弓形虫属以及新孢子虫属。在根据本专利技术的特别优选方法中，第一抗原是猪II型环状病毒(PCV-2)抗原，尤其是PCV-20RF2抗原。在根据本专利技术的方法中待使用的PCV-20RF2抗原代表约30kDa的蛋白，并且用作可商购的PCV2疫苗中的活性组分，所述疫苗如Porcilis PCV (Intervet/Schering-Plough Animal Health, Netherlands), Ingelvac CircoFLEX(BoehringerIngelheim Vetmedica Inc.，USA)以及 Suvaxyn PCV (Fort Dodge Animal Health, USA)。根据本专利技术的方法中待使用的PCV-2 0RF2可以例如从体外培养的感染了重组杆状病毒的昆虫细胞获得，所述重组杆状病毒用编码PCV-2 0RF2蛋白的基因转化并且在昆虫细胞中表达该蛋白(Fort et al., Vaccine 27,4031-403本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.29 EP 10181634.6;2010.08.27 US 61/377485;21.一种测定至少含有第一抗原的组合物、以及含有(i)第二抗原和(ii)能够结合第一抗原的抗体的组合物的混合物中第一一抗原的抗原含量的方法，所述方法包括以下步骤， A解离混合物中第一抗原和抗体间形成的抗原-抗体复合物，和 B通过免疫测定来确定第一抗原的抗原含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第一抗原是PCV-2抗原，且第二抗原是猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)抗原。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于免疫测定是ELISA(酶联免疫吸附测定)。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于混合物是即用型的疫苗制剂。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于将混合物与酸溶液孵育以解离抗原-抗体复合物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于酸溶液是柠檬酸溶液。7.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·阿伦，M·加雷特，U·P·布鲁德雷尔，M·A·J·蒂森，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：
国别省市：
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