本发明专利技术涉及包含特异性引物-探针组的试剂盒，其借助于实时PCRTaqMan探针技术用于检测肉产品中存在的驴肉。本发明专利技术能够检测直到0.1皮克的驴肉污染。用对驴物种具有特异性的试剂盒，借助于直到第40个循环与马、猪、牛、绵羊、鸡和火鸡物种无交叉反应，特异性检测在生和热处理的肉混合物中的驴肉成为可能。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含特异性引物-探针组的试剂盒，其借助于实时PCR TaqMan探针技术用于检测肉产品中存在的驴肉。
技术介绍
聚合酶链反应(PCR)简言之是通过与侧接待扩增的DNA区段的3’ -末端互补的短单链寡核苷酸序列(引物)，对DNA上的一个或多个靶区的酶促扩增过程。在PCR应用中，在扩增属于任何生物的特异性基因或基因区域以获得足够的遗传材料用于分析后，可以使用次级方法通过进一步分析扩增子(PCR产物)执行物种鉴定。近年来，开始使用给出定量结果的实时聚合酶链反应(PCR)方法，以便检测肉产品中的物种。在实时PCR方法中，靶基因的扩增通过增加的荧光信号进行监控，所述荧光信号与反应中的PCR产物量按比例增加。在实时PCR方法中，水解探针(TaqMan 探针)方法在为检测肉物种执行的研究中是特别优选的，因为发出的荧光信号的强度与每个循环中产生的PCR产物(扩增子)的量平行。在这种方法中，使用荧光标记的寡核苷酸探针(荧光标记的短单链寡核苷酸分子)。它设计为在PCR反应的退火和延伸期期间退火到引物内部的靶序列。以其游离完整形式，无法测量荧光发射，因为报道染料的荧光发射被猝灭染料吸收。然而，一旦在探针退火到靶链之一后，探针将被Taq聚合酶的5’ _3’外切核酸酶活性降解。因此，报道和猝灭染料变得分离，并且报道染料的发射不再转移至猝灭染料，导致报道荧光发射增加。这个过程在每个循环中发生且不干扰PCR产物的指数累积。荧光的增加按循环进行测量且与形成的PCR产物量直接关联。在其下超过阈值的循环数目称为“Ct (循环阈值)值”，并且它给出关于靶DNA区域的起始量的信息。对于靶物种特 异性的PCR引物仅在合适反应条件下在它们对于其特异性的DNA的存在下产生PCR产物。待扩增的DNA片段根据所检测的目的个体、群体、物种或家族所显示的差异水平进行选择。待用于物种区分的靶DNA片段的碱基序列需要显示出在物种之间的最大差异和在物种内的个体和群体之间的最小差异。因此，将在靶向基因区域的扩增中使用的寡核苷酸引物和探针的特异性直接鉴定方法的特异性。关于用实时PCR TaqMan探针技术检测肉产品中的驴的首个和仅有研究已由Chisholm等人执行。他们使用TaqMan探针方法执行关于马和驴物种的检测的研究，并且他们使用线粒体细胞色素b (cytb)基因设计引物和探针。但是他们的研究中使用的方法在第30个循环(Ct 30)后不足以区分紧密相关的物种，并且出现非特异性反应。扩增子大小对于马物种是69 bp (碱基对)，并且对于驴物种是119 bp。马特异性引物和探针组显示出牛和驴DNA的非特异性反应。并且对于驴特异性的引物和探针组引起与马DNA的交叉反应(Ct 30.77)。在这个应用中，发现对于马的检测极限是25ng和对于驴的检测极限是Ing0Doole等人描述了通过使用在线粒体细胞色素b (cytb)上设计的特异性引物和探针组的基于实时PCR的检测方法，以便鉴定在肉和肉产品中存在的牛、绵羊、猪、火鸡和鸡物种组织。对于猪特异性的引物和探针组显示出与牛、绵羊、鸡和火鸡的交叉反应。对于这些物种检测到的Ct值分别为31.13,37.08,30.00,34.64，并且对于猪的理论检测极限是0.02%。Tanabe等人在线粒体细胞色素b基因上设计了对于猪、鸡、牛、绵羊和马特异性的引物和探针，并且用实时PCR TaqMan技术以100 fg/水平检测每个物种。Jonker等人也开发了通过使用物种特异性引物和探针组以0.01%水平用于鉴定加工的肉产品中存在的牛、猪、马、绵羊、鸡和火鸡物种的实时PCR方法。Frezza等人可以通过使用16S rRNA基因以0.01-0.05ng水平检测牛和绵羊物种，以及通过使用细胞色素b基因以0.5ng水平检测鸡和猪物种。K5ppel等人开发了通过使用P -肌动蛋白和促乳素受体基因以0.32_32ng水平用于检测牛、猪、鸡和火鸡物种的多重实时PCR方法。现有技术已知的申请，国际专利文件号W02007119066，公开了致使食物中存在的肉类中的动物组织能够通过使用PCR技术进行检测的试剂盒。专利技术概述本专利技术的目的是实现包含用于检测其它肉产品中的驴肉的特异性引物探针组的试剂盒。本专利技术的另一个目的是实现包含特异性引物探针组的试剂盒，其致使能够检测到肉产品中直到0.1皮克的驴DNA。本专利技术的其他目的是实现包含特异性引物探针组的试剂盒，其直到第40个循环不显示与可以存在于反应混合物中的属于其他动物物种的DNA的任何交叉反应，并且因此仅显示与驴DNA的反应，并且致使能够特异性检测驴物种。本专利技术的另外一个目的是实现包含特异性引物探针组的试剂盒，其致使能够检测热处理的肉产品中的驴DNA。专利技术详述实现为达到本专利技术的目的的“用于检测肉产品中的驴肉的试剂盒”在附图中举例说明，其中(附图说明图1)是响应在0.0001和IOOng之间的驴DNA的DNA稀释度所接受的荧光信号视图。(图2)是响应驴DNA的对数浓度检测到的Ct值之间的线性关系视图。本专利技术包含借助于实时PCR TaqMan探针技术用于检测肉产品中存在的驴肉的特异性引物-探针组。特异性引物-探针组是用实时PCR技术检测驴物种所需的组分之一。在试剂盒内，存在设计为对于驴物种特异性的具有21个核苷酸长度的正向引物，对于驴物种特异性的具有18个核苷酸长度的反向引物，和其为具有28个核苷酸长度的水解探针的TaqMan探针,其可以特异性退火到用正向和反向引物扩增的区域。在试剂盒内还存在无核酸酶水和实时PCR反应混合物。第一次DNA分离应从肉产品完成，以便通过使用试剂盒检测驴物种。分离的DNA的纯度需要很高，它不应包含PCR抑制剂，并且其260/280nm比应是至少1.7。实时反应在200 μl的PCR管和50μl的总体积中执行。反应混合物由以下组成:商购可得的实时PCR主混合物(25 μl)(在实时PCR主混合物中:存在HotStarTaq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP混合物和8 mM MgCl2),0.8 μ M正向和反向引物、0.2 μ M TaqMan探针、2μ M分离的DNA(其浓度小于500ng)和21.2 μl无核酸酶水。在实时PCR装置中，使用对于在其下用于标记TaqMan探针的荧光染料(报道荧光色素)的激发和发射的波长合适的滤光器。执行的温度循环为在95°C激活15分钟后在95°C 15秒、在60°C I分钟共40个循环。提及的试剂盒中存在的弓丨物探针组由正向引物、反向引物和双重标记的寡核苷酸探针组成，它们互补靶向线粒体DNA NADH脱氢酶亚单位5基因(ND5)上的区域(图表I)。引物-探针组包括位于ND5基因(登记号X97337)上的11802-11823核苷酸之间的21核苷酸长度正向引物；位于11867-11884核苷酸之间的20核苷酸长度反向引物；和位于11827-11855核苷酸之间的28核苷酸长度双重标记的寡核苷酸探针(表I)。在引物探针组的设计中，线粒体DNA (MtDNA)的重复数目和针对热效应分解的抗性高于核DNA (nDNA)。由于这个原因，选择线粒体DNA，因为它致使能够检测驴物种，其具有足够高的突变率以致使能够即使在低浓度下测定并本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：H耶蒂姆，F萨欣，Z科斯门，
申请(专利权)人：耶迪特普大学，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。