寡核苷酸标记及其鉴定方法技术

本发明专利技术提供了寡核苷酸标记和使用其鉴定物质的方法。所述寡核苷酸标记使短时间内以高精确性分析痕量的物质成为可能，具有改进的在油性溶剂中的溶解度，并且可以改进检测方法从而使得在2小时内可检测到所述寡核苷酸标记。所述寡核苷酸标记可标记多种产品(包括油产品和石油产品，艺术品和收藏品)，并且可用于进行犯罪调查。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。
技术介绍
寡核苷酸具有独特的优势，这是由于它们即使以很少的量存在也可通过聚合酶链式反应(PCR)大量扩增，并且其原始的核苷酸序列可通过核苷酸测序确定。因此，当将很少量的这种寡核苷酸添加至多种物质或产品(包括油、涂料(paint)、爆炸物和艺术品)时，可以精确地测定物质或产品的最初来源或运输途径，或者产品是否真实的。一般使用添加荧光剂、色素或特定化学物质的方法来标记油产品。但是问题在于:很难对很少量的样品进行定量分析，很难对多种产品进行标记，操作者可造成污染，并且可进行变造(manipulation)例如移除标记。用于寡核苷酸合成仪的标准合成法是亚磷酸三酯法。在亚磷酸三酯法中，形成DNA结构骨架的磷酸二酯键使用￠-氰乙基亚磷酰胺产生。在该方法中，从连接有核苷的固体支持物开始，通过重复由去保护(deblocking)、偶联、加帽和氧化组成的合成过程来合成具有期望长度的寡核苷酸。作为合成过程的第一步的去保护步骤起始于使DMT从固体支持物上脱离，去保护步骤生成的5'-羟基与核苷亚磷酰胺单体发生偶联反应，以合成具有期望核苷酸序列的寡核苷酸。去保护步骤在酸性条件下使用三氯乙酸或二氯乙酸进行。偶联步骤后，未反应的5'-羟基可以参与下一偶联步骤以生成具有不期望核苷酸序列的(n-1)mer，因此，使未反应的5'-羟基通过用乙酸酐和N-甲基咪唑乙酰化进行加帽。偶联步骤得到的结构为亚磷酸酯，用碘将其氧化以将其转化成磷酸酯形式，这是实际DNA结构的一部分。重复上述合成过程使得合成具有期望长度的寡核苷酸。合成完成后，用氨处理使合成的寡核苷酸从固体支持物上脱离，3 -氰乙氧基被从中去除，从而使得所合成的寡核苷酸恢复为形成DNA结构骨架的磷酸二酯键。由于在中性pH下磷酸二酯键带负电，所以由多个磷酸二酯键组成的寡核苷酸显示强亲水性。因此，寡核苷酸易溶于水溶液，但一般不溶于有机溶剂。该特性导致寡核苷酸溶解于有机溶剂中时溶解度低的问题。对于使用这种DNA标记对象的方法，W087/06383公开了可作为标记使用的核苷酸，但未公开通过DNA扩增或测序鉴定对象的方法，并且未公开在有机溶剂中溶解亲水性DNA的方法。W090/14441公开了·使用去污剂将DNA溶于油中，从而将亲水性DNA引入有机层的技术。然而，W090/14441仅公开了使用特定引物检测DNA是否扩增来确定DNA存在与否。而且，其未提及使用DNA的核苷酸序列作为鉴定标记。此外，使用去污剂时，DNA在有机层中以反向胶束的形式存在，以致其聚集而不是在分子水平上分散。另外，以反向胶束形式引入有机层的DNA可容易地被提取至水层，从而可能被去除。W091/17265公开了通过用特定引物(W090/14441中描述的)扩增基因来确定基因的核苷酸序列，还公开了 DNA可与固体支持物或物质共价连接。对于W091/17265的公开，当核苷酸直接与涂料或油成键时，在提取和收集寡核苷酸的过程中共价键会被破坏，从而改变核苷酸。因此，寡核苷酸不能扩增为准确序列，因此它们难以被商业化。W094/14918公开了基因扩增和测序的更为改进的方法，其使用两种或更多种发光物质或显色化合物作为标记。然而，该方法也未考虑到寡核苷酸的羟基或核苷酸的氨基的反应性。由于羟基或氨基部分的反应，在进行聚合酶链式反应(PCR)或核苷酸测序时无法得到具有原始序列的寡核苷酸。美国专利N0.5665538公开了监测水溶液中石油物质运动的方法，包括在石油物质中添加微轨迹添加剂(microtrace additive)。使用DNA以0.01-1000pg/DNA/ U I的终浓度将微轨迹添加剂加入至石油物质中。将DNA配制为可溶于石油物质，从而微轨迹添加剂的疏水性使其分配到石油物质中。该制剂确保DNA溶解于或分散于石油物质中，从而使得其基本上不被水性清洗除去。含微轨迹添加剂的石油物质在其移动后取样，然后将微轨迹添加剂从石油物质中取出，最后通过扩增反应对DNA微轨迹添加剂进行检测。美国专利公开2007/0065876公开了标记系统，其包含具有不同大小的寡核苷酸的组合。每个DNA包括三个片段，其中中间片段具有根据寡核苷酸的长度而不同的长度，从而使得这种不同的长度作为编码，并且两个末端片段为具有不同序列的引物。引物作为检测元件来确定物质的存在与否。寡核苷酸DNA通过扩增进行检测。美国专利N0.5451505公开了监测暴露于自然紫外照射的物质是否存在的方法，其包括使用至少20个且少于1，000个核苷酸的核酸使物质(如空气污染物、油或芳族化合物)标签化，以使所述物质和核酸暴露于自然紫外照射的方式释放经标签化的物质，收集核酸，用聚合酶链式反应扩增所述核酸，并且监测物质的存在。EP1171633公开了包含相同探针序列和不同引物序列的核苷酸标签，还公开了这样的核苷酸标签序列，其中正向引物和探针是固定的，而反向引物是变化的。其中，通过用引物和荧光标记之标签进行的PCR对样品中的核苷酸标签进行定量检测，从而允许定量测定物质中标记的量。 为了克服现有技术的上述局限性，以申请人名义申请的韩国专利申请N0.10-0851764公开了在亲脂性溶剂中具有提高的溶解度的寡核苷酸，以及使用其鉴定物质的方法。同样，以申请人名义申请的韩国专利申请N0.10-0851765公开了寡核苷酸标记以及使用其检测交通工具的方法，所述寡核苷酸标记添加至交通工具涂层膜并且适于用作交通工具鉴定标记。根据所公开的方法，可通过以下用核苷酸序列信息跟踪和监视物质:提取溶于涂料的痕量寡核苷酸，收集所述寡核苷酸，通过PCR扩增所收集的寡核苷酸，然后对所扩增的寡核苷酸进行测序。在该方法中，需要解码核苷酸序列的过程，因为序列信息是编码的。由于分析成本、精确性、时间消耗以及过程的复杂性，分析核苷酸序列的方法不易商业化，并且以简单而迅速的方式确定物质的编码信息(内部使用的鉴定编号，例如批号、生产商等)以及物质是否真实存在局限性。此外，由于市场上存在多种质量的油，油等级的变造以及非标准汽油的流通造成了问题。因此，为了控制制造商的品牌形象并且在这些的流通中建立秩序，需要能够鉴定流通油的种类和质量的技术
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的是提供更稳定的寡核苷酸，以及用寡核苷酸标记物质并且在短时间内从物质中回收和鉴定经标记的寡核苷酸标记的方法。问题的解决方法一方面，本专利技术 提供了连接有阳离子型相转移剂(cationic phase transferagent)(为季铵盐化合物或阳离子表面活性剂)的寡核苷酸，以及使用所述寡核苷酸标记物质并且在短时间内从物质中回收和鉴定经标记寡核苷酸标记的方法。下文将对本专利技术进行详细说明。一方面，本专利技术提供了用于鉴定物质的寡核苷酸标记，所述寡核苷酸标记为连接有阳离子型相转移剂(为季铵盐化合物或阳离子表面活性剂)的寡核苷酸，所述寡核苷酸标记包含用于实时聚合酶链式反应(PCR)的探针序列和连接至探针序列两端的引物序列。本专利技术中，所述阳离子型相转移剂可为烷基季铵离子(quaternaryalkylammonium ion),如四丁基氢氧化铵或十六烧基三甲基溴化铵。本专利技术中，所述寡核苷酸的末端可被封闭剂封闭，其中所述封闭剂不含化学物质或末端基团，例如脂质或磷酸酯/盐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.03 KR 10-2010-00864681.一种用于鉴定物质的寡核苷酸标记，所述寡核苷酸标记为连接有阳离子型相转移剂的寡核苷酸，并且包含用于实时聚合酶链式反应(PCR)的探针序列和连接于所述探针序列两端的引物序列。2.根据权利要求1的寡核苷酸标记，其中所述寡核苷酸的末端被封闭剂封闭。3.根据权利要求2的寡核苷酸标记，其中所述封闭剂不含化学物质或末端基团，其为脂质或磷酸酯/盐。4.根据权利要求1的寡核苷酸标记，其中所述寡核苷酸包含与含有I至50个碳原子的有机化合物连接的反应性氮和氧部分。5.根据权利要求1的寡核苷酸标记，其中所述寡核苷酸的长度为20至1000个核苷酸。6.一种用于鉴定物质的方法，所述方法包括向物质中添加权利要求1所述的寡核苷酸标记。7.根据权利要求6的方法，其中所述物质选自交通工具涂层的涂料、漆、交通线涂料、石油、涂料稀释剂、冲淡剂、爆炸物、天然油，建筑涂料、有机溶剂、粘合剂、染料、肉...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴翰浯，李在敦，宋邱永，吴锺亿，金铉培，卞相轸，张镇雄，蒋沅锡，崔锺德，
申请(专利权)人：株式会社百奥尼，
类型：
国别省市：