【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和微生物发酵领域，具体涉及一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法。
技术介绍
5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一种含氧元素和氮元素的碳氢化合物，是生物体合成四氢吡咯的前体，还是卟啉、(亚铁)血红素、叶绿素以及维生素B12的结构类似物。ALA是一种生理活性非常活跃的非蛋白类氨基酸，其应用范围非常广阔。在农业上，作为一种光活化绿色无公害的除草剂、杀虫剂、抗微生物药剂和植物生长促进剂而得到广泛应用。在医学上，ALA被应用到癌症的光动力学治疗和诊断上；还具有促进血红素生成的作用。另外，5-氨基乙酰丙酸作为外用药可用于痤疮的治疗和作为生发剂使用。ALA在生物体内存在着两条合成途经(如附图说明图1所示)，一种途径称为碳四途径(C4pathway),存在于动物、真菌和α家族细菌中，由5_氨基乙酰丙酸合酶(ALA synthase,ALAS)催化琥珀酰COA和甘氨酸缩合成ALA。另一条途径被称为碳五途径(C5 pathway)，存在于植物、藻类以及大部分细菌中，ALA来源于谷氨酸的碳骨架，由3个酶催化。由碳四途径和碳五途径获得的ALA均被共同的下游代谢酶ALA脱水酶催化形成胆色素原，然后进一步向下游转化。大肠杆菌本身通过C5途径合成ALA，但是，由于大肠杆菌不需要合成叶绿素，仅需要以ALA为前体合成少量的维生素B12等四吡咯类化合物，因此其天然的ALA合成能力很弱。 目前，ALA的合成方法分为化学法和生物法两种。化学合成法合成步骤复杂，原料来途径窄，合成造价较高，致使目前ALA产品市场价格昂贵(约326美元/克)，制约了它...
【技术保护点】
一种在大肠杆菌构建5?氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因，其特征在于借助pETDuet?1载体，共表达三个基因：ALA合成酶基因hemA、辅酶A转移酶基因cat和ALA分泌基因YBi，所述基因序列如下：ggggaattgt?gagcggataa?caattcccct?ctagaaataa?ttttgtttaa?ctttaagaag????gagatatacc?atgggcagca?gccatcacca?tcatcaccac?agccaggatc?cgaattcatg????gactacaatc?tggcactcga?taccgctctg?aaccggctcc?ataccgaggg?ccggtaccgg????accttcatcg?acatcgagcg?gcgcaagggt?gccttcccga?aagccatgtg?gcgcaagccc????gacgggagcg?agaaggaaat?caccgtctgg?tgcggcaacg?actatctcgg?catgggccag????catccggtgg?tgctgggggc?catgcacgag?gcgctggatt?cgaccggcgc...
【技术特征摘要】
1.一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因，其特征在于借助pETDuet-Ι载体，共表达三个基因:ALA合成酶基因Ae▲辅酶A转移酶基因cat和ALA分泌基因！Si，所述基因序列如下:2.一种如权利要求1所述的在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因的构建方法，其特征在于其按照以下步骤顺序进行: (1)以Rhodobacter sphaeroides基因组为模板，利用引物hemA -F和hemA -R扩增hemA基因; (2)通致以Propionibacteriumshermanil基因组为模板，利用和扩增Cat基因； (3)ALA分泌基因Wi借助启动子表达-.V丄Escherichiacoli基因组为模板，通过重叠PCR，利用引物Prom-F、Prom-R, Yb1-F、7况-7 得到含有完整表达盒的YBi基因； (4)各基因片段经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，并与pMD18-T simple载体连接，转化万.co7i DH5a ； (5)涂布在含100μ g/L Amp的LB固体培养基上，蓝白斑筛选的阳性克隆经质粒PCR及酶切鉴定后进行测序； (6)共同表达载体pETA、pETAC、pETACY的构建 质粒pETDuet-Ι和质粒pMD18-T- hemA分别用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶将两片段连接得到质粒pETA ;将质粒pETA和质粒pMD18-T-fei分别用限制性内切酶Nde I进行单酶切，回收两目的片段，将Cat基因片段作为插入片段连接到PETA单酶切得到的较大片段上，得到重组质粒pETAC ； 质粒pETAC和质粒pMD 18-T-7Si分别用限制性内切酶Not I进行单酶切，回收两目的酶切片段，将ALA分泌基因Wi连接到pETAC单酶切得到的较大片段上，得到重组质粒pETACY ;将以上构建得到的质粒载体转化万.coli DH5 a，提取质粒，采用酶切和PCR方法鉴定阳性克隆； (7)重组质粒的诱导表达 将重组质粒pETA、pETAC、pETACY分别转化到E.coli BL21 (DE3)中，菌株分别命名为E.coli K,B.coli AC,B.coli ACY，挑取含重组质粒的BL21 (DE3)单菌落，接种至含50 μ g/L Amp的...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯惠勇，刘天佳，李天明，戴宝新，刘静文，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：
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