本发明专利技术公开了一种具有心肌保护作用的融合肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。本发明专利技术的一种具有心肌保护作用的融合肽，其特征在于具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。对本发明专利技术所得到的融合肽进行生物活性研究发现，本发明专利技术的融合肽对心律失常、室颤、心肌缺血、心肌梗死以及心肌细胞凋亡等心脏有关疾病能够起到治疗或预防的效果。此外，本发明专利技术还提出了一种制备该融合肽的方法及其在制备具有心肌保护作用药物中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种融合肽及其制备方法和应用，特别涉及ー种具有心肌保护作用的融合肽及其制备方法和应用。属于生物制药领域。
技术介绍
心肌缺血再灌注损伤是高等动物机体缺血后再灌注发生的普遍现象，是导致心力衰竭和心律失常的重要诱因，因此寻找适合且疗效确切的防治缺血再灌注损伤方法，一直是心血管领域的研究热点、难点。尽管实验证明，缺血预适应对缺血性心脏病患者的心肌保护具有显著作用，但因需要在心肌梗死发生前进行，其临床应用大大受限。“内源性心肌保护学说”成为当前心血管研究的前沿领域，诸多试验证实，心脏中存在着许多内源性、具有细胞保护性质的物质，从而使心肌细胞生命活动处于动态平衡状态，寻找可控的内源性心肌保护分子并加以体外改构或药物诱导成为ー种防治心脏重大疾病的新策略。目前已知，腺苷，一氧化氮和降钙素基因相关肽(Calcitonin Generelated Peptide, CGRP)等为内源性物质，但是它们的作用过于迅速維持时间短，主要靶器官为神经和血管，且易降解，成药性差，不适合长期给予患者进行治疗。此外，我们对内源性心肌保护分子的认识只是站在起跑线上，在没有掌握全部心肌保护分子相关功能意义的状况下，当前对内源性心肌保护分子机制的认识是不完整的。Betaglycan，也称做转化生长因子三型受体(TGFPRIII)，是全长为851个氨基酸蛋白多糖，为TGF-0信号超家族成员。目前已证实，跨膜蛋白聚糖betaglycan由以下三部分组成:较长的766个氨基酸的胞外区域(soluble ectodomain, s-betaglycan),疏水的跨膜区域(transmembrane region, TMD),较短42个氨基酸组成的胞质区域(cytoplasmicdomain, c_betaglycan),作为ー个非共价联合的同型ニ聚体表达于细胞表面。全长betaglycan伴随着胞外近端区域向跨膜区域的部分蛋白水解后释放可溶性的胞外区域成为s-betaglycan, s-betaglycan可在细胞培养液和血清中被检测到。有人采用在体实验表明，给接种肿瘤动物注射s-betaglycan也可显著抑制前列腺癌，乳腺癌和子宮内膜癌的生长，且没有出现任何有毒性的副反应，但是对胶质瘤并没有明显作用。在多数早期癌症中betaglycan表达缺失,表明betaglycan可能抑制了癌症的进展。而对betaglycan在心脏疾病中的作用，和网络信号转导以及调控机制尚不清楚。目前发现ー个s-betaglycan的改构合成肽可以明显抑制自发性高血压大鼠心肌的纤维化，这与其抑制TGF-Pl介导的胶原合成有夫。此外，我们通过瞬时过表达全长betaglycan,可以明显看到betaglycan抑制重度缺氧引起的心肌成纤维细胞的凋亡,其具体机制与抑制TGF- β信号通路介导的Bax/Bcl-2凋亡信号通路有夫。但是上述研究仅仅是在心脏成纤维细胞中，而且是对全长或s-betaglycan功能进行研究,对于其在心肌细胞中是否表达，其功能特别是c-betaglycan的功能如何尚不清楚。众所周知心肌缺血再灌注损伤病理生理学变化为心肌重构过程中产生的心肌细胞的凋亡以及重要离子通道功能的失衡，从而导致心衰、心律失常重大疾病的发生。我们前期研究已证实betaglycan在心肌中存在高丰度表达，比心肌成纤维细胞中表达高1.7倍。在心肌缺血再灌注损伤过程中，其表达显著下降。前期TUNEUTdT介导的dUTP缺ロ末端标记技术)和电镜观察结果表明，瞬时转染全长betaglycan可以显著抑制缺氧复氧心肌细胞诱导凋亡。已报道betaglycan在切割掉胞外片段后，其胞浆片段c-betaglycan是稳定的且具有活性。因此，我们设计并合成改造的c-betaglycan融合肽，即采用c-betaglycan和转导肽相连,利用转导肽将融合肽导入细胞。为了分别比较s-betalgycan和c-betaglycan是否对缺氧复氧造成心肌细胞凋亡都有保护作用，我们进行体外试验将细胞培养液中分别加入s-betalgycan和c-betaglycan,发现二者均具有抗心肌细胞凋亡作用。综合以上发现，我们通过人工合成或者基因工程的方法构建出具有高效的心肌保护作用的融合肽，并且对其生物学活性进行研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供ー种具有心肌保护作用的融合肽。为此，本专利技术采用化学合成或者基因工程的方法，构建ー种高效抗心肌缺血、心率失常等心脏有关疾病的融合肽，并对其生物学活性进行了研究。本专利技术的ー种具有心肌保护作用的融合肽，其特征在于具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。优选的，本专利技术的ー种具有心肌保护作用的融合肽，如SEQ ID N0.1所示(RKKRRQRRRWGTGETAGQQVPTSPPASENSSAAHSIGSTQSTPCSSSSTG)，其全长 50 个氨基酸，N 端的 9 个氨基酸以碱性氨基酸为主，组成转导肽(穿膜肽)，能将后面连接的c-betaglycan导入细胞质。其后加入的W为色氨酸，便于生产过程中用紫外检测多肽浓度；G为甘氨酸，与其后的TG等小分子氨基酸构成柔性连接，保证其后的c-betaglycan立体结构不会因引入转导肽而发生改变，保持活性。c-betaglycan C端的丙氨酸改为甘氨酸，使化学合成与基因工程获得的融合肽在结构上保持一致。进ー步的，本专利技术还提出了编码所述的融合肽的核苷酸序列。优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主菌也应在本专利技术的保护范围之内。对本专利技术所得到的c-betaglycan融合肽进行生物活性研究发现，本专利技术的融合肽能够提供心脏保护作用，对心律失常、室颤、心肌缺血、心肌梗死以及心肌细胞凋亡等心脏有关疾病能够起到治疗或预防的效果。因此，再进ー步的，本专利技术还提出了所述的融合肽以及所述的核苷酸序列在制备具有心肌保护作用药物中的应用。其中，所述的具有心肌保护作用药物是用于预防或治疗心律失常、室颤、心肌缺血、心肌梗死以及心肌细胞凋亡等心脏有关疾病。更进一歩的，本专利技术 还提出了一种通过基因工程获得具有心肌保护作用的融合肽的方法，其特征在于包括以下步骤:选用大肠杆菌偏爱密码合成用于表达所述融合肽的核苷酸序列，具体序列如SEQ ID N0.3所示，用多核苷酸激酶使合成的基因5’端磷酸化，用NdeI和Smal酶切质粒pTYB2，与目标基因重组，转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，表达融合蛋白，提取蛋白，纯化，即得。所述的SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列是在编码链(SEQ ID N0.2所示)的5'端増加TATG序列，其中的ATG为起始密码，TA为NdeI酶切后产生的单链粘端，3 '端为c-betaglycan C端第二位氨基酸-苏氨酸密码,为平端。用多核苷酸激酶使合成的基因5'端磷酸化，用NdeI和Smal酶切质粒pTYB2，与目标基因重组，转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，融合肽以融合肽-内含肽-几丁质结合蛋白这种融合蛋白的形式表达，经几丁质亲和层析，内含肽在几丁质柱内裂解，释放融合肽，并在融合肽的C端增添ー个甘氨酸。通过一步层析直接本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有心肌保护作用的融合肽，其特征在于具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.ー种具有心肌保护作用的融合肽，其特征在于具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述的融合肽的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQID N0.2所/Jn o4.ー种表达载体,其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。5.—种宿主菌,其特征在于含有权利要求4所述的表达载体。6.权利要求1所述的融合肽在制备具有心肌保护作用药物中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的具有心肌保护作用药物用于预防或治疗心律失常、室颤、心肌缺血、心肌梗死以及心肌细胞凋亡等心脏有关疾病。8...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨宝峰，初文峰，刘兴汉，吕延杰，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：
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