光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法技术

本发明专利技术是一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，该方法将纯化后的目标蛋白均匀混入脂立方样品后，对样品进行一个温度逐级升高的梯度加热/冷却过程。每一步升温后，水分子会析出脂立方样品而使样品变得浑浊，因此重新冷却样品并高速离心，使水分子重新进入脂立方，让样品变回无色透明状态。然后通过采集样品的荧光信号，鉴定目标蛋白的稳定性。本发明专利技术方法设计合理，可操作性强，可以实现在脂立方样品中直接测定蛋白的稳定性，为随后的晶体和相关研究提供了数据和理论的支持。本发明专利技术方法中应用的基因也可以为蛋白已经各类小分子的控制研究提供支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质基因工程
，具体涉及一种通过光谱学测定脂立方样品中的膜蛋白的活性以和稳定性的方法。
技术介绍
早在I960年研究者就已经证明，亲水性和疏水性的两性分子在水中可以形成很多形态各异结构的理论。1962年Iuzzati的研究组测定了层状相的结构，也获得了六角相的电子显微结构。随后不久，又用X射线技术测定了类脂立方相的结构。1968年Iuzzati与加拿大的研究专家对脂质-水体系(lipid-water system)进行了 X射线的研究,得到了脂质-水体系的随脂质浓度和温度变化的部分相图。1980年Iarsson提出，立方液晶中无限循环排列的脂双层膜非常类似于生物膜中的脂双层膜。1990年Engtoom S.及其同事根据脂质立方液晶的结构特点，提出可以将类脂立方液晶用作药物载体。脂质立方相(Lipidiccubic phase, LCP)应用于膜蛋白结晶最早是在1996年，Landau & Rosenbusch通过脂质立方相获得了第一个完整的细菌视紫红质蛋白的2.5埃的晶体结构。在此之后，通过脂质立方相结晶膜蛋白就成为一个很实用的技术，并被广泛传播。实践证明，这项技术对于阐明膜蛋白的结构机制是至关重要的，近年来，通过LCP获得了很多关键蛋白的结构信息，譬如，各种细菌视紫红质蛋白以及第一个高分辨率的人源G蛋白偶联受体(2-adrenergicreceptor)。运用脂质立方相能成功获得高分辨率膜蛋白晶体，主要归结为以下两个原因:第一，与使用去垢剂与蛋白形成微球的恶劣环境不同，脂质立方相提供了一个更加接近天然的类似生物膜的环境；第二，在脂质立方相中，晶体生长时蛋白分子是按照I型堆积方式堆积，也就是蛋白分子不仅通过亲水部位相互作用堆积，也通过疏水部位相互接触而堆积，从而使得晶体结构更加有序，所含的水更少。到目前为止，通过LCP获得的晶体结构达102个，蛋白种类达22种，晶型27种。因此，我们可以看出LCP为结构生物学研究提供了一个强有力的工具，在未来膜蛋白结构生物学研究中将扮演着举足轻重的角色。在获得更多的蛋白结晶并解析其结构的基础上，我们可以来进行基于蛋白结构的药物设计，从而更加有效快速的筛选潜在药物，减少药物研发的成本和周期，并且可以有效的提闻药物的疗效和减少药物的副作用。热稳定性越闻的蛋白，其相应结晶成功率也就越高。因此为了更好的用脂立方技术进行蛋白结晶实验，筛选有前景的蛋白construct又是其中的重中之重。另外，脂立方主要的脂质和脂质添加剂，以及限定可能的沉淀剂和缓冲液的范围，都有可能影响蛋白的热稳定性。现有技术中，蛋白的热稳定性测定办法非常多，包括底物结合曲线，圆二色光谱，升温曲线等等。然而这些技术都是基于蛋白在溶液中的情况，并不反映蛋白在脂立方样品中的具体表现。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法设计合理、可操作性强、可以在脂立方样品内直接测定膜蛋白的稳定性的方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种，其特点是，其步骤如下: (1)表达和纯化目标蛋白；在从^1网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液； (2)将膜蛋白溶液混入脂立方样品； ①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从-20°C的冰箱取出中，加热至37-40°C后形成液态；前述脂类分子选自1，2 - 二油酰-sn-甘油-3 -磷酸胆碱，1，2_ 二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1，2_ 二油酰-sn-甘油基-3 -磷脂酰甘油，1，2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上； ②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20-24°C，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋白的最终浓度为0.5-2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百分比为38-42% ;同时以不含前述膜蛋白的缓冲液作对照； ③当一个均匀和透明的脂立方样品形成后，将50-70微升的脂立方样品转移到石英比色皿中，密封；在5600父8和18-22°C的条件下离心； (3)膜蛋白在脂立方样品中的稳定性测定； 采集石英比色皿中脂立方样品的初始吸光度和内在蛋白荧光光谱后，立即对样品进行升温，升温采用5-10°C为一升温梯度`循序进行，每一梯度升温进行后，需要采用前述方法离心并进行吸光度和内在蛋白荧光光谱采集；升温的最高温度不超过100°C;以不含膜蛋白的缓冲液按前述方法进行对照；将采集的吸光度和内在蛋白荧光光谱一起以图表画出，即可得到蛋白的退火温度；退火温度越高说明膜蛋白温度性越高，反之亦然；从而实现膜蛋白稳定性的测定。本专利技术所述的方法中:步骤(2)所述的甘油一油酸酯与脂类分子混合物可以采用以下方法配制:将甘油一油酸酯与所述的脂类分子按比例置于适量的氯仿中，使用氮气流蒸发大部分溶剂，随后在真空21-23°C下处理至少12小时，除尽其余的残留氯仿后，在-20°C下储存。与现有技术相比，本专利技术的优点在于: (I)本专利技术方法设计合理，可操作性强，可以实现在脂立方样品中直接测定蛋白的稳定性，为随后的晶体和相关研究提供了数据和理论的支持。(2)本专利技术方法中应用的基因也可以为蛋白已经各类小分子的控制研究提供支持。附图说明图1为在甘油一油酸酯和其它脂质分子组成的脂立方中，β 2肾上腺素受体，以及β 2肾上腺素受体-Τ4溶菌酶融合蛋白与噻吗洛尔结合的热稳定性 图2为在甘油一油酸酯和不同的pH值缓冲液组成的脂立方中，肾上腺素受体-T4溶菌酶融合蛋白与噻吗洛尔结合物的热稳定性图。具体实施例方式以下进一步描述本专利技术的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本专利技术，而不构成对其权利的限制。实施例1，一种，其步骤如下: (1)表达和纯化目标蛋白；在从^1网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液； (2)将膜蛋白溶液混入脂立方样品； ①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从-20°C的冰箱取出中，加热至37-40°C后形成液态；前述脂类分子选自1，2 - 二油酰-sn-甘油-3 -磷酸胆碱，1，2_ 二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1，2_ 二油酰-sn-甘油基-3 -磷脂酰甘油，1，2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上； ②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20-24°C，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋 白的最终浓度为0.5-2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百分比为38-42% ;同时以不含前述膜蛋白的缓冲液作对照； ③当一个均匀和透明的脂立方样品形成后，将50-70微升的脂立方样品转移到石英比色皿中，密封；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）表达和纯化目标蛋白；在NCBI网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液；（2）将膜蛋白溶液混入脂立方样品；①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从‑20℃的冰箱取出中，加热至37‑40℃后形成液态；前述脂类分子选自1,2 ‑ 二油酰‑sn‑甘油‑3 ‑ 磷酸胆碱，1,2‑二油酰‑SN‑甘油基‑3‑磷脂酰乙醇胺，1,2‑二油酰‑sn‑甘油基‑3 ‑ 磷脂酰甘油，1,2‑二油酰‑SN‑甘油基‑3‑磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上；②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20‑24℃，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋白的最终浓度为0.5‑2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百分比为38‑42％；同时以不含前述膜蛋白的缓冲液作对照；③当一个均匀和透明的脂立方样品形成后，将50‑70微升的脂立方样品转移到石英比色皿中，密封；在5600×g和18‑22℃的条件下离心；（3）膜蛋白在脂立方样品中的稳定性测定；采集石英比色皿中脂立方样品的初始吸光度和内在蛋白荧光光谱后，立即对样品进行升温，升温采用5‑10℃为一升温梯度循序进行，每一梯度升温进行后，需要采用前述方法离心并进行吸光度和内在蛋白荧光光谱采集；升温的最高温度不超过100℃；以不含膜蛋白的缓冲液按前述方法进行对照；将采集的吸光度和内在蛋白荧光光谱一起以图表画出，即可得到蛋白的退火温度；退火温度越高说明膜蛋白温度性越高，反之亦然；从而实现膜蛋白稳定性的测定。...

【技术特征摘要】
1.一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，其特征在于，其步骤如下: (1)表达和纯化目标蛋白；在从^1网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液； (2)将膜蛋白溶液混入脂立方样品； ①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从-20°C的冰箱取出中，加热至37-40°C后形成液态；前述脂类分子选自1，2 - 二油酰-sn-甘油-3 -磷酸胆碱，1，2_ 二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1，2_ 二油酰-sn-甘油基-3 -磷脂酰甘油，1，2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上； ②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20-24°C，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋白的最终浓度为0.5-2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟，许恒皓，尹欣，卢辰，高嵩，程斌，
申请(专利权)人：连云港脂立方生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32