苹果锈果类病毒分子标准样品及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种苹果锈果类病毒分子标准样品及其制备方法，具体包括ASSVd的原料选取、标准样品的制备、均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等过程。所述标准样品的制备方法包括：由ASSVd病毒液中提取病毒RNA、RT‑PCR反应扩增并纯化目的基因片段、目的片段的连接转化；回收质粒的步骤。本发明专利技术的苹果锈果类病毒标准样品稳定性高、均匀性好，适用于对苹果锈果类病毒进行快速检测确证，为苹果锈果类病毒的检测研究、农药研究、应用研究提供了标准样品的需求，可广泛应用于农业生产及环境中的疫情监控及进出口贸易中该类病毒的监测及检测。使用本发明专利技术的标准样品可以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测用病毒标准品及其制备方法
，具体涉及苹果锈果类病毒标准样品及其制备方法。
技术介绍
类病毒(Viroid)是一种最小的具有侵染性的致病病原，它是由247～375核苷酸组成的单链、共价闭合的环状RNA，能引起许多经济作物产生严重病害。已经发现的类病毒已超过30种，其核酸含有246～399个核苷酸，根据序列和结构的同源性、复制特性分为2个组，分别为马铃薯纺锤块茎类病毒组(PSTVd)和鳄梨日斑类病毒组(ASBVd)。苹果锈果类病毒(Apple scar skid viroid,ASSVd)归于苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)，粒体由330个核苷酸组成。苹果锈果类病毒的侵染寄主是苹果和梨。感病的苹果因品种和环境条件的变化表现出5种显性病症:锈果型、花脸型、锈果-花脸型、环斑型和绿点型，感病的梨大多数表现为隐性，少数为畸形果。由于类病毒在寄主植物细胞核中复制和累积，在感病寄主的叶、茎、皮、砧木，以及果实的表皮、果肉和种子中均可检测出类病毒。因此，感染类病毒的果树终生带毒，并通过嫁接和修剪工具传染的途径使类病毒病蔓延。许多国家的苹果树和梨树中均发现ASSVd的危害，我国东北、西北、华北，以及江苏、安徽、山西和山东等地亦有发生。目前尚未有苹果锈果类病毒的检测鉴定方法的规范性操作规程。因此，规范苹果锈果类病毒的检测鉴定方法一般操作规程，对于提高苹果锈果类病毒的检疫检验效率、防止苹果锈果类病毒的传入、传出，保护我国农业的安全生产，促进我国农产品的顺利出口，具有十分重要的意义。植物类病毒由于不显性侵染比较普遍，症状表现受环境温度的影响较大，而且几种鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，故难于应用生物测定的方法。由于类病毒不能产生任何蛋白质，所以也不能使用检测病毒的血清学方法。因此，选用RT-PCR方法对苹果锈果类病毒进行检测。系统内送检种苗的样品通常眼观来看都比较健康，而苹果锈果类病毒通常只有在适宜的条件下才能发病，而且现在用的PCR方法只能从重度感染表现出症状的植物中检出病毒，无法检测潜在的病毒。随着进出口贸易的增大，检验流程时限要求缩减，植物病毒疫病多数要进行分子生物学检测，现行的国家和行业标准，都需要标准阳性毒株或阳性对照质控物进行实验质控，这些阳性毒株的引进需要办理复杂的审批手续，购置费用昂贵，难度较大，因此普通的植物疫病实验室很难得到该病毒，对实验室的质量控制及研究带来了极大的挑战。为了帮助实验室建立规范的质量保证，植物病毒及类病毒的标准样品研制工作一直在开展中。目前，国内外还没有关于该种植物类病毒标准样品的研究。我们将首次开发可用于快
速检测苹果锈果类病毒的分子标准样品及制备技术。本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。该专利技术成果将有望成为植物疫病分子诊断领域的突破性产品及技术，是植物流行病学检测技术体系的进一步完善和发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种稳定性高、均匀性好的苹果锈果类病毒分子标准样品及其制备方法。为了得到所述苹果锈果类病毒分子标准样品，根据苹果锈果类病毒(ASSVd)基因全序列，设计全序列及特异性引物，其碱基序列如下：SEQ ID NO：1:GTAAACACCGTGCGGTTCCTSEQ ID NO：2:AAGAGCGTGAGAGAACAGGG本专利技术的苹果锈果类病毒分子标准样品，采用如下方法制备：(1)采集感染苹果锈果类病毒的植物组织，液氮研磨；(2)步骤(1)得到的植物组织中提取得到病毒RNA；(3)步骤(2)的病毒RNA作为PCR反应模板，进行RT-PCR扩增反应，其中PCR反应的正反引物分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；(4)将步骤(3)的PCR扩增产物经纯化后连接至PGEM-T载体中，连接产物转化至感受态细胞后，LB平板培养，筛选得到阳性克隆；(5)阳性克隆中提取得到质粒，即为苹果锈果类病毒的标准样品；上述制备方法中,在步骤(4)中筛选阳性克隆的方法为RT-PCR方法，其中RT-PCR反应的正反引物分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2本专利技术的苹果锈果类病毒分子标准样品稳定性高、均匀性好，为苹果锈果类病毒的检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。使用本专利技术的标准样品可以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。附图说明图1为实施例1中ASSVd目标基因的PCR扩增反应产物的电泳图，其中M：DL2000Marker,1～9：空白质粒及健康对照；10:PCR扩增产物扩增出273bp大小的片段。图2为是本专利技术标准样品灵敏度检测结果图，其中由左到右，依次是10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8。具体实施方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。苹果锈果类病毒分子标准样品及其制备方法按如下步骤进行：实施例1苹果锈果类病毒分子标准样品的制备(1)提取病毒RNA；采集0.1g感染苹果锈果类病毒的植物组织加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入1mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃～8℃，12000g，离心10min。取上清，15℃～30℃，放置5min；加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡(勿涡旋振荡)，15s。15℃～30℃，放置2min～3min；2℃～8℃，12000g，离心15min。小心吸取约为600μL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500μL异丙醇混合上清液，15℃～30℃，放置10min。2℃～8℃，12000g，离心10min。去除上清液，沉淀中加入1mL 75％乙醇，洗涤；2℃～8℃，7500g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30μL～50μL无RNase的水中，即为待检模板RNA。(2)目标基因的扩增步骤(1)的病毒RNA作为PCR反应模板，本专利技术自行设计引物，进行RT-PCR扩增反应，扩增苹果锈果类病毒基因全序列，大小为273bp的片段，其中PCR反应的正反引物序列如下：SEQ ID NO：1:GTAAACACCGTGCGGTTCCTSEQ ID NO：2:AAGAGCGTGAGAGAACAGGG扩增溶液中加入2×RT-PCR buffer(10倍聚合酶链式Mix反应液)12.5μL,10pmol/μL SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.5μL，将提取的待测样品RNA加入反应体系中，DEPC水补足体积至25μL，PCR循环条件为：48℃30min，94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸45s，共循环35次；然后72℃再延伸10min.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苹果锈果类病毒的标准样品，其特征在于，制备步骤包括：(1)采集感染苹果锈果类病毒的植物组织，液氮研磨；(2)步骤(1)得到的植物组织中提取得到病毒RNA；(3)步骤(2)的病毒RNA作为PCR反应模板，进行RT‑PCR扩增反应，其中PCR反应的正反引物分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；(4)将步骤(3)的PCR扩增产物经纯化后连接至PGEM‑T载体中，连接产物转化至感受态细胞后，LB平板培养，筛选得到阳性克隆；(5)阳性克隆中提取得到质粒，即为苹果锈果类病毒的标准样品；其中所述感受态细胞为E.coli JM109。

【技术特征摘要】
1. 一种苹果锈果类病毒的标准样品，其特征在于，制备步骤包括：(1)采集感染苹果锈果类病毒的植物组织，液氮研磨；(2)步骤(1)得到的植物组织中提取得到病毒RNA；(3)步骤(2)的病毒RNA作为PCR反应模板，进行RT-PCR扩增反应，其中PCR反应的正反引物分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成标，吴兴海，孙敏，李明哲，赵丽青，尼秀媚，唐静，郑小龙，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37