【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及的应用领域包含蛋白质折叠及其途径的研究，蛋白质工程，抗体工程，分子生物学，免疫生物学，治疗性药物，生物技术，生物技术蛋白药物产品，蛋白质分类学，和用以开发新型功能性蛋白质材料的纳米技术。
技术介绍
蛋白质必须正确折叠才能够实现其生物学功能。其线性多肽链在核糖体上合成后需被转运到其他部位形成适当的二级、三级、四级结构。蛋白质的错误折叠会引发许多疾病，如肌肉萎缩性疾病，老年痴呆症(Alzheimer’ sdisease)，皮质纹状体脊髓变性综合症(the Creutzfeld Jakob disease),羊瘙库症和疯牛病(Bovine spongiformeEnzephalopathie BSE)。研究专利技术一种行之有效的工艺方法用来解释蛋白质的折叠机制，说明疾病的成因继而开发新型的治疗药物，至今仍是生命科学界一项重大的挑战。安芬森(Christian Anfinsen, 1972,诺贝尔化学奖)关于蛋白质复性的实验使人们知道,蛋白质的一级结构含有蛋白质结构的全部信息。然而他仍无法解释蛋白质如何折叠以及如何找到它们的天然构象。近几十年来，世界各国的...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.05 DE 1020100260941.征和多维展示蛋白质折叠过程的新方法，其特征在于，对所有在折叠过程中以不同时间间隔通过化学修饰捕捉到的具有不同构象的蛋白质折叠中间体可以至少根据其各自拥有的4个特性，即其水合动力学分子大小、其形成时间点、其归属的折叠路径以及其形成的量的多少来进行鉴别和数字化描绘，被表征的蛋白质折叠过程可由4个阶段组成。该方法适用于对所有蛋白质折叠途径的特征描述，包括以下步骤: 1)基于对蛋白质一级结构、二级结构和有可能的多维结构特征以及蛋白质的生物和理化性质分析，制作相应的理论片段质量识别模板，确定进一步的操作方法和实施方式； 2)通过蛋白质变性、还原、必要时去除还原剂、色谱分离和波谱检测，制备完全变性去折叠具有最大水合动力学分子大小的蛋白质样品； 3)对折叠过程中和可能同时被氧化的蛋白质的动态修饰，其中，所有在不同时间间隔产生的折叠中间体被按序取出，根据它们被修饰氨基酸残基的特性，使用相应的侧链修饰试剂，不同程度的进行修饰，使之形成各自相对稳定的结构和各自独有的特性，即水合动力学分子大小、形成时间点、归属的折叠路径以及量化值； 4)分离和量化中间体并展示他们的水合动力学分子大小和必要时它们的量化值对应于它们形成时间的函数关系，其中，所有在折叠过程中被修饰的中间体可用电泳法或用与波谱检测偶合(首选使用动态光散射)的色谱法进行分离、量化、数字化储存、以备后用，同时多维展示它们水合动力学分子大小与形成时间的函数关系，形成蛋白质折叠过程的指纹图谱； 5)中间体的片段化，其中，为了鉴别区分中间体，对在不同时间间隔形成、被修饰、分离和其水合动力学分子大小已得以区分的折叠中间体进行酶解片段化，首选使用胰蛋白酶，必要时可用其它内切酶、外肽酶以及化学方法； 6)中间体片段的检测，其中，使用各类质谱对所有单个片段的分子量以及由二硫键和/或交联剂结合的中间体大片段的分子量，进行精确测量，数据储存入库并分类制成折叠中间体片段质量识别检测表； 7)中间体折叠路径归属性的确定，其中，通过对用质谱法整理的片段数量和质量与理论片段质量识别模板参照比较可以确定每个中间体发生修饰的类型、数量和位置作为各自的特征，并鉴于这些个性特征将中间体按照它们的共同之处划类归组，赋予其组分归属性，归属性相同的中间体给定一个特定的折叠路径，也即可由一个中间体的组归属性确定其折叠路径的归属，对此可进一步用蛋白质进化理论和蛋白质折叠动力学理论来补充和完善。8)中间体的鉴定和分类，其中，每一个中间体都可以至少用它们被测定的水动力学尺寸大小、形成时间、数量、折叠路径来标记和区分鉴定。根据它们的特征的一致性，所有被鉴定的中间体可以被分为若干小组，并以此划归不同折叠途径。被归类于某个折叠途径的中间体还可以满足三个标准，即它们具有相同的修饰类型，它们的水合动力学分子大小逐渐减小，它们沿着折叠路径形成的时序明确； 9)折叠过程的表征，其中，通过在多维坐标系里并行标记所有被鉴定的在不同折叠路径上的中间体可以直接确定天然折叠的主导路径，最快和最慢折叠的路径，导致错误折叠的路径，所有折叠路径的折叠动力学，二硫键形成和/或交联形成的次序，折叠结节的形成，分子重排和折叠路径的分 支、延伸、交叉、穿越和交汇以及与此相关的中间体等等，蛋白质的折叠过程由此得以表征；10)蛋白质折叠过程的图形和可视化展示，其中，已表征的蛋白质折叠过程可以通过定义坐标借助计算机图形学的方法在多维坐标系中以多种形式包括动画可视化展示，还可通过重新组合和转换融合所定义的坐标扩展可视化展示的多样性。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤3)至少使用一种下列的实施方式， -对含有二硫键蛋白质的动态修饰， -对不含二硫键蛋白质的动态修饰 -对多结构域蛋白质的动态修饰 -对体外模拟共翻译和翻译后的动态修饰 -对体外模拟蛋白质折叠的动态修饰 -对蛋白质生物合成的体外动态修饰 和至少一种下列的操作方法， -单项修饰，其中，选择性地只针对一种氨基酸的残基使用一种特异性侧链反应试剂在最佳反应条件下进行的修饰化学反应； -多项修饰，其中，选择性地对一种或多于一种氨基酸的残基使用一种或多于一种侧链反应试剂在不同的反应条件下进行的修饰化学反应，反应可以单独进行也可分别进行后混合； -分子内交联修饰，其中，选择性地使用双端功能侧链反应试剂在不同的反应条件下以不同的实施方式进行的双重修饰化学反应； 和至少满足一种下列的反应动力学， -修饰反应速率的时间尺度范围从纳秒、微秒到毫秒，包括氢键的形成、二级结构单元的形成、肽链的疏水折拢； -修饰反应速率的时间尺度范围从毫秒到分钟，涉及到快速折叠阶段和形成折叠路径早期中间体的阶段； -修饰反应速率的时间尺度范围从毫秒到数分钟，适用于研究以秒至数小时或数日的速率折叠的蛋白质，大多涉及到缓慢折叠阶段，其间，继续产生归属不同折叠路径的中间体，出现相对稳定的溶球态紧密结构，所有中间体持续折叠，直到重新折叠到他的原始天然结构状态，并达到最低能量状态。和至少使用一种下列化学试剂药品， -蛋白质的变性剂， -蛋白质二硫键的还原剂， -蛋白质的氧化剂，包括与它们相配的组合物及变量组份，主要用以修饰含有二硫键的蛋白质， -含有或不含有同位素标记的有效特异性侧链基团修饰试剂， -含有突光和电子自旋标记报告基团的修饰剂和其它标记修饰试剂， -用以分子内标记的零长度直接交联剂、双端同源功能交联剂、双端异源功能交联剂、光敏标记修饰试剂， -生物素标记试剂， -试剂和/或酶用来蛋白质共翻译或翻译后的修饰， -各类细胞提取物，-折叠酶和/或者伴侣蛋白， -折叠酶和/或伴侣蛋白的备选抑制剂， -影响蛋白质折叠和降解的化学和生物性备选活性物质， -影响蛋白质体外共翻译修饰的化学和生物性备选活性物质， -影响蛋白质体外翻译后修饰的化学和生物性备选活性物质， -影响蛋白质体外生物合成的化学和生物性备选活性物质， -蛋白质折叠的辅助及稳定剂。3.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤4)可以手工进行也可以根据本发明的构思和设计自动化和微型化进行，并采用至少一种下列操作形式， -优先使用针对球形亲水蛋白质的聚丙烯凝胶电泳，使用至少一种下列的改进措施， -连接一个可以在电泳过程中控制电泳缓冲液浓度、组成、PH值的输送系统，它可以通过在缓冲液储缸的阴极端连接一个充满所需缓冲液并有渗透性元件的容器装置来实现，也可以通过在缓冲液的阴极端配装一个用细管与外面盛有所需缓冲液容器相连接的溶液分配器来实现。这可使所需的缓冲液根据需要的速度连续或不连续的且按需定量的输入电泳系统； -通过在电泳过程中对缓冲溶液的输入调节来动态控制和优化折叠中间体的分离分辨率和清晰度。由此可行的对缓冲液的浓度、组成、PH值的动态调整和设定提高了蛋白质折叠中间体之间的电荷、极性以及离子流的差异。在这里提高的分离分辨力不再仅仅基于蛋白质分子本身的电荷分布和构型形式，还取决于那些由此新引入的辨别因子，即动态改变的折叠中间体的表面电荷和极性分布，以及它们与额外离子流不同的相互作用； -应用脉冲驱动电泳技术，通过短时间提高电压、短时间改变缓冲液组份的极性和/或者浓度、短时间的调换电泳电极，结合使用高度疏水的反离子以便聚焦单条泳带和扩增含有折叠中间体泳带之间的距离； -使用不同成分和性状的凝胶，比如:对于较大的蛋白，可以采用孔梯度凝胶来分离。-电泳设备或者和一个有效的冷却恒温器相连，或者将其和由制冷元件和液体循环冷却槽构成的装置组装在一起，以便凝胶及时得以散热，减少折叠中间体由于热效应引起的在凝胶泳带之间的扩散 -和光谱分析仪器，如动态和静态散射仪，耦合连接的液相色谱、微型电泳层析柱、微型化的场流分离(FFF)，用以分离区别它们的水合动力学分子大小。这些仪器适合于分离区分所有蛋白质中间体的水合动力学分子大小，特别是针对一些不适于电泳分离的蛋白质，包括强酸性、强碱性、疏水性的蛋白质，还有膜蛋白和非常大的蛋白质，其操作形式如下所列。-单级柱液相色谱，即按照需求与波谱仪器耦合连接的用不同的分离介质填装的微型凝胶色谱柱或者微型场流分离器，用以直接确定每个分离组份里折叠中间体的水合动力学分子大小的顺序； -多级柱液相色谱，即按照需求对与光谱测量方法联用的微型分离柱进行串联和/或并联的组合，微型分离柱包括凝胶色谱柱、羟磷灰石柱、疏水柱、离子交换柱、反相色谱柱、亲和色谱柱，还有微型场流分离器等，专用于分离一些水合动力学分子大小非常接近和折置路径的归属尚未确定的折置中间体； -波谱学区分与量化，即对分离后分别置于系列小容器或微孔试验板内的折叠中间体的水合动力学分子大小进行波谱学鉴别，首选使用动态和静态光散射设备，也使用荧光、紫外/可见光、圆二色法、核磁共振、傅立叶变换红外、电子自旋共振等技术； -折叠中间物的特异区分，即对单个分离样品中的折叠中间物，它们要么具有不同的水合动力学分子大小，要么具有近似的水合动力学分子大小但可能属于不同的折叠途径，可以使用本发明改进的动态和静态光散射装置，它们的区分能力可以通过以下至少一种方法得以提闻: -通过延长检测时间来提高分辨率， -通过程控升温的熔点温度(Tm)区分， -通过对样品用内置的真空蒸发或通风浓缩装置单元进行的浓度改变， -通过使用微型自动滴定器或手动移加所需缓冲液组分...
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