体干细胞制造技术

本发明专利技术揭示一体干细胞群及其制法。亦揭示其二亚群以及此等的各种用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】体干细胞相关申请本专利技术系依据2010年8月4日申请的美国临时申请案61/370，600号、2010年9月17日申请的美国临时申请案61/383，842号、2011年2月25日申请的美国临时申请案61/446，669号请求优先权。此等前案以全文引用的方式纳入本案中。
技术介绍
干细胞为在活体内或试管内可分化成许多或所有细胞谱系(cell lineages)的多能性(pluripotent)或全能性(totipotent)细胞。由于其的多能性,一般相信胚胎干(ES)细胞具有治疗退化性或遗传性疾病的远大前景。但是伦理上的考虑阻碍了人类干细胞的使用。非胚胎来源的干细胞则可规避该障碍。因此，对于非胚胎干细胞具有需求。
技术实现思路
本专利技术系关于体干细胞，其为多能性或全能性，以及相关方法。一方面，本专利技术的特征为经离析的体干细胞，其尺寸为0.3至6.0微米(尺寸为，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)且为⑶9+。该经离析的体干细胞可为⑶9+CD349+或⑶9+⑶349_。细胞标记(marker)后的符号“ + ”代表用标记-特异性抗体染色时显示较强的荧光，而用该抗体的同型(isotype)对照组染色时显示较弱的荧光。细胞标记后的符号代表用标记-特异性抗体染色时所显示的荧光强度与用该抗体的同型对照组染色时所显示者相同。在一具体实施例中，该经离析的体干细胞为非吸附性。在本文中该细胞被称为“SB-1”细胞。另一方面，本专利技术的特征为经离析的体干细胞，其尺寸为0.3至6.0微米(尺寸为，例如，0.3至5.0微米、0.3 至4.0微米及0.3至3.0微米)且为SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Strol+。在一具体实施例中，该经离析的体干细胞为非吸附性。在本文中该细胞被称为“SB-2” 细胞。又另一方面，本专利技术的特征为制造体干细胞群的方法。该方法包括:从个体(例如人类或非人类)得到含有多个细胞的体液(例如血液、骨髓、脐带血、月经、及羊水)样品；将该样品与二价阳离子螯合剂(例如，EDTA、EGTA、及柠檬酸钠)或肝素(heparin)在容器中培养直至该样品分为上层及下层；收集该上层；以及从该上层离析一群尺寸为0.3至6.0微米的体干细胞(尺寸为，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)。在该上层中的细胞在本文中被称为“SB细胞”或“SB细胞群”。在SB细胞群中的体干细胞可为CD9+、SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Strol+。例如其可为⑶9+⑶349+。此等体干细胞非为吸附性且可具有受精卵细胞的形态及生长特征。再者，其可被诱发生成所有3层胚层，即内胚层、外胚层及中胚层。来自上层的SB细胞的离析可借由根据细胞尺寸的方法(例如离心或过滤)或根据细胞表面标记的方法(例如流式细胞测量术)进行。该方法进一步包括于收集该上层后，将其与ADP —起培养以允许血小板/微粒沉淀而使干细胞进一步富化(enriched)。此外,该方法亦包括将从肝素处理过的的样品得到的的上层与二价阳离子螯合剂一起培育，以使干细胞活化而从细胞周期GO进入G1。再一方面，本专利技术的特征为借由上述方法制备的SB细胞群。又再一方面，本专利技术的特征为细胞银行，其包括多个群的体干细胞。此等群系借由上述方法从不同个体的体液样品(例如血液及骨髓)分开制备。本专利技术的进一步特征为增加样品中所含的干细胞的数目的方法。该方法包括:将二价阳离子螯合剂加至该样品中以及将该样品中的干细胞与二价阳离子螯合剂一起培养。该方法进一步包括在加入螯合剂的前及将该等细胞与螯合剂一起培养的后测定样品中所述及的细胞(例如SB-1细胞、SB-2细胞、以及SB-1细胞与SB-2细胞二者)的计数。待用本方法检验的干细胞的例子包括在SB群中的干细胞，例如SB-1细胞。评估个体是否有老化相关性异常或癌症的危险的方法亦在本专利技术的范围内。老化相关性异常的例子包括:自行-修复缺陷、退化性疾病、自体免疫疾病、心血管疾病或糖尿病。该方法包括:个体取得某些体干细胞群，以及测定该体干细胞的计数。所得到的体干细胞可为 SB-1 细胞或 SB-2 细胞。此等可为 CD9+、CD349+、SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或 Strol+。此等各个的尺寸为0.3至6.0微米。在SB群中的干细胞可借由上述方法得到，较佳使用肝素以将体液样品分离成上层及下层。若该计数低于第一预定值，则该个体被认定有罹患该异常的危险，或者若该计数高于第二预定值，则该个体有罹患癌症的危险。第一值可从年轻且健康的第一对照个体得至IJ。第二值可从罹患癌症的第二对照个体得到。本专利技术亦包括在个体中增加体干细胞的数目的方法。该方法包括将有效量的在SB细胞群中的体干细胞投与至需要其的个体。于投与的前及的后可测定在来自该个体的样品(例如血液及骨髓)中所述及的细胞(诸如SB-1细胞)的个别计数。举例言之，为了实施该方法。可使用在含有10ηΜ-5 μ M EDTA的250毫升磷酸盐缓冲液中的体干细胞。最后，本专利技术的特征为治疗肌肉受伤或肌肉退化性疾病的方法。该方法包含将有效量的在SB细胞群中的体干细胞投与至需要其的个体。该肌肉退化性疾病的例子包括肌肉营养不良症、纤维肌痛、肌肉病变、皮肌炎、多发性肌炎、横纹肌溶解症或心肌炎。本专利技术的一个或多个具体实施例的细节述于附图及以下说明中。从该说明及附图以及从权利要求可显而易知本专利技术的其他特征、目的及优点。附图说明图1包括5个散点图(scatter plot),其显示估计Pl-圈选区(Pl-gated region)中的细胞的尺寸用的标准珠粒的尺寸。图2包括3个散点图，其显示当以流式细胞测量术分析时在P3-圈选区中各具有小于6微米的尺寸的细胞。左图为显示具有大(> 6微米)、小细胞二者的全血的图；中间图为显示纯化后在SB细胞群中的细胞的图；以及右图为显示只有缓冲液的图。 图3包括3个散点图，其显示在P3-圈选区的SB细胞群，该SB细胞群包括在P2-圈选区的SB-1细胞及在P5-圈选区的SB-2细胞。注意缓冲液、血小板及微粒分别在P4-、P1-、P2-圈选区中。图4包括2个散点图，其显示在P2-圈选区的SB-1细胞，该SB-1细胞系从血液中离析而来。如左侧格所示，几乎所有的SB-1细胞以SYTO染色时皆呈阳性。图5包括2个散点图，其显示在P5-圈选区的SB-2细胞，该SB_2细胞系从血液中离析而来。如左图所示，几乎所有的SB-2细胞以SYTO染色时皆呈阴性。图6包括2个散点图，其显示在P6-圈选区的红血球，该红血球系从血液中离析而来。如左图所示，所有红血球以SYTO染色时皆呈阴性。详细说明本专利技术至少部分系基于下述未预期的发现:(i)多能性或全能性干细胞群，即SB细胞群可从一般相信不含细胞的样品中离析出；(ii) 二价阳离子螯合剂(例如EDTA)会活化该群中的多能性或全能性干细胞并在未使其丧失其分化潜力下强迫其增殖；以及(iii)该多能性或全能性干细胞群可被分化成外胚层、内胚层及中胚层细胞。在该群中的SB-1细胞针对CD9染色时呈阳性，在该群中的SB-2细胞于染色时下述标记的I个或多个呈阳性，即SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Strol+。SB细胞群、SB-本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.04 US 61/370,600;2010.09.17 US 61/383,842;1.种经离析的体干细胞，其尺寸为0.3至6.0微米且为⑶9+。2.权利要求1所述的经离析的体干细胞，其中该经离析的体干细胞为多能性或全能性。3.权利要求1所述的经离析的体干细胞,其中该细胞为人类细胞。4.权利要求1所述的经离析的体干细胞，其中该细胞为非吸附性。5.权利要求1所述的经离析的体干细胞，其中该细胞为⑶9+CD349+。6.种经离析的体干细胞，其尺寸为0.3至6.0微米且为SSEA1+、SSEA4+、⑶13+、或Strol+o7.权利要求6所述的经离析的体干细胞，其中该经离析的体干细胞为多能性或全能性。8.权利要求6所述的经离析的体干细胞，其中该细胞为人类细胞。9.权利要求6所述的经离析的体干细胞，其中该细胞为非吸附性。10.种制造体干细胞群的方法，该方法包含: 从个体得到含有多个细胞的体液样品； 将该样品与EDTA或肝素(hepar in)在容器中培养直至该样品分为上层及下层； 收集该上层；以及 从该上层离析一群尺寸为0.3至6.0微米的体干细胞。11.权利要求10所述的方法，其中该体液样品为血液或骨髓样品。12.权利要求10所述的方法，其中该个体为人类。13.权利要求10所述的方法，其中该离析步骤系借由离心、流式细胞测量术或过滤而进行。14.权利要求10所述的方法，其于收集步骤的后，进一步包含将上层与ADP—起培养。15.权利要求10所述的方法，其中该培养步骤系借由将该样品与肝素一起培养，以及于收集步骤的后及离析步骤的前，将所收集到的上层进一步与EDTA —起培养而进行。16.种体干细胞群，其系借由如权利要求10所述的方法制备。17.权利要求16所述的体干细胞群，其中该体干细胞为CD9+。18.权利要求17所述的体干细胞群，其中该体干细胞为⑶9+CD349+。19.权利要求16所述的体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王俊麟，
申请(专利权)人：干细胞生物科技公司，
类型：
国别省市：