在细胞培养物中生产重组高分子量vWF的方法技术

除了其它方面以外，本发明专利技术涉及用于生产高分子量vWF（具体地，具有高比活性的高度多聚的WF和具有高比活性的ADAMTS13）的细胞培养条件。本发明专利技术的细胞培养条件可以包括，例如，具有增加的铜浓度的细胞培养基和/或具有低铵(NH4+)浓度的细胞培养物上清液。本发明专利技术也提供了在细胞培养条件中培养细胞以表达具有高比活性的高分子量vWF和rA13的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2010年7月8日提交的美国临时专利申请系列号61/362，635的优先权，其公开内容特此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
技术介绍
治疗性蛋白在细胞培养物(特别是大规模细胞培养物，包括真核细胞培养物和更具体的哺乳动物细胞培养物)中的重组表达，需要使用特殊培养基，所述特殊培养基为细胞的有效生长提供营养物质。经常给细胞培养基制剂补充多种添加剂，包括胎牛血清(FCS)、动物衍生的蛋白和/或牛源蛋白水解物以及从植物或酵母衍生出的蛋白水解物。使用这种培养物的一项挑战是，甚至当细胞培养基的制剂没有变化时，在不同的细胞培养物之间，蛋白的量和生产的蛋白的总活性和比活性经常会变化。在使用10升至超过20，000升的细胞培养体积的大规模生产工艺的情况下，该变化性是特别明显的。含有水解物的细胞培养基特别易于随细胞培养物不同而变化，从而导致减少的总蛋白产量以及降低的总活性和比活性。在不同的细胞培养物之间看到的变化性的一个潜在原因是，在添加剂(诸如水解物)中的污染物随批次不同而变化。一般而言，血清或血清衍生的物质(例如白蛋白、转铁蛋白或胰岛素)可以包含不想要的试剂，所述试剂可污染细胞培养物和由其获得的生物制品。此外,必须针对所有已知病毒(包括可通过血清传播的肝炎病毒和HIV)测试人血清衍生的添加剂。此外，牛血清和从其衍生的制品具有BSE污染的风险。此外，所有血清衍生的制品可被未知物质污染。当使用血清或从细胞培养中的人或动物来源衍生的蛋白添加剂时，存在许多问题(例如，不同批次的组合物的不同质量以及被支原体属、病毒或BSE污染的风险)，特别是如果细胞被用于制造用于人施用的药物或疫苗时。因此，已作出许多努力以提供不需要血清或其它动物蛋白化合物的有效宿主系统和培养条件。已基于衍生自植物或酵母的蛋白提取物开发了这样的无血清培养基。例如，已知大豆水解物对于发酵方法是有用的，并且可增强许多需要复杂营养的生物体、酵母和真菌的生长。W096/26266描述了大豆粉(soymeal)的木瓜蛋白酶消化物是碳水化合物和氮的来源，并且许多组分可用于组织培养。Franek等人(BiotechnologyProgress (2000) 16，688-692)描述了确定的大豆和小麦水解物肽级分的生长和生产力促进效应。W096/15231公开了由合成的最低必需培养基和酵母浸出物组成的无血清培养基，其用于脊椎动物细胞的繁殖和病毒生产过程。由基础细胞培养基(其包含水稻肽和酵母提取物及其酶消化物)和/或用于培养动物细胞的植物脂质组成的培养基制剂公开于W098/15614中。用于培养重组细胞的包含纯化的大豆水解物的培养基公开于W001/23527中。W000/03000公开了包含大豆水解物和酵母提取物的培养基， 但是该培养基也需要重组形式的动物蛋白(例如生长因子)的存在。EP-A-0481791描述了用于培养工程改造的CHO细胞的生物化学成分确定(biochemically defined)的培养基,其不含从动物来源分离的蛋白、脂质和碳水化合物，其还包含重组胰岛素或胰岛素类似物、1%至0.025%w/v的木瓜蛋白酶消化的大豆蛋白胨和腐胺。W098/08934描述了一种无血清真核细胞培养物，其包含水解的大豆肽(1-1OOOmg/L)、0.01-lmg/L腐胺和多种动物衍生的组分(包括白蛋白、胎球蛋白、多种激素和其它蛋白)。在该背景下，应当指出，还已知腐胺以0.08mg/L的浓度包含在标准培养基(如DMEM/Ham’ sF12)中。然而，植物和/或酵母水解物是寡肽和其它未知组分和污染物的成分不明确的混合物。此外，水解物的商购可得批次的质量变化极大。因此，重组蛋白或病毒产物的产量随着所使用的水解物的批次而存在较大变异(最高达3倍的变异)(“批间变异”)。该缺点会影响细胞的增殖以及每种细胞的蛋白表达。US2007/0212770描述了不同的不含动物蛋白的且不含寡肽的化学成分确定(chemically defined)的培养基,所述培养基可用于重组蛋白生物药剂的大规模生产。 止血包含不同止血反应途径的相互作用，最终导致血栓形成。血栓是血液组分在血管壁的表面上的沉着物，其主要由聚集的血小板和不溶性的交联的纤维蛋白组成。纤维蛋白形成是凝血酶(一种凝结酶)对纤维蛋白原的限制性蛋白酶解的结果。凝血酶是凝血连锁和多种血管细胞的终产物，所述凝血连锁是在活化的血小板和白血球的表面上发生的一系列酶原活化(综述参见:K.G.Mann等人，Blood, 1990，第76卷，第1-16页)。凝血连锁的一项重要功能是，通过活化的因子IX(因子IXa)和活化的因子VIII (因子VIIIa)的复合物对因子X的活化。该复合物的组分的缺乏或功能障碍与称作血友病的血液疾病有关(J.E.Sadler 和 E.W.Davie:HemophiIia A, Hemophilia B, and vonffillebrand, s Disease, G.Stamatoyannopoulos 等人(编):The molecular basis ofblood diseases, ff.B.SaundersC0., Philadelphia, 1987,第 576-602 页)。A 型血友病是与因子VIII活性的缺乏有关，而B型血友病与因子IX缺乏有关。当前的治疗包括补偿疗法，其中使用包含正常凝血因子的药物制剂。在这些血小板病中，A型血友病更经常地发生，影响大约1/10，000的人。A型血友病患者的补偿疗法包括:通过静脉内输注，重复施用含有正常因子VIII的制剂。输注之间之间隔随血液循环中的因子VIII活性的降解而变化。在输注以后因子VIII活性的半衰期随个体不同而异，在10-30小时的范围内。因而，预防性治疗需要每2-3天输注I次。这对血友病患者的生活造成沉重负担，具体地，如果静脉接入已经变得困难(由于静脉内输注进行频繁的针穿刺以后造成的局部citratization)。如果通过使用具有延长的半衰期的因子VIII来降低输注频率，将是特别有利的。本领域众所周知的是，未活化的因子VIII异源二聚体的半衰期强烈地依赖于vonWillebrand因子的存在，所述von Willebrand因子表现出对因子VIII的(但是对因子VIIIa则没有)强亲和力并充当载体蛋白(J.E.Sadler和E.ff.Davie:HemophiIiaA, Hemophilia B and von ffillebrand, s Disease, G.Stamatoynnopoulos 等人(编):Themolecular basis of blood diseases, ff.B.SaundersC0., Philadelphia, 1987，第 576-602页)。已知的是，遭受3型von Willebrand氏病的患者(其在血液循环中不具有可检测的von Willebrand因子)也遭受继发性的因子VIII缺乏。另外，静脉内地施用的因子VIII在这些患者中的半衰期是2-4小时，这比在A型血友病患者中观察到的10-30小时明显更短。从这些发现得出结论:因子VIII倾向于从血液循环中快速地清除，并且该过程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.08 US 61/362,6351.一种用于生产重组Von Willebrand因子(rVWF)组合物的方法，所述方法包括下述步骤: (a)提供基础细胞培养基； (b)给所述基础细胞培养基补充铜，以提供至少2.4 μ g/L的最终铜浓度； (c)提供一个或多个细胞，所述一个或多个细胞包含编码rVWF蛋白的核酸； (d)在补充了铜的细胞培养基中培养所述一个或多个细胞，使得所述细胞表达rVWF并将其分泌进培养物上清液中；和 (e)回收所述培养物上清液的至少一部分， 其中所述回收的上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少30mU/l.! g rVWF。2.根据权利要求1所述的方法，其另外包括下述步骤:在培养所述一个或多个细胞之前，用水解物补充所述基础细胞培养基。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述水解物是植物水解物。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述水解物是大豆水解物。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是不含动物蛋白的培养基。6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是不含蛋白的培养基。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是化学成分确定的培养基。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述补充铜的基础细胞培养基的最终铜浓度是至少4 μ g/L铜。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述补充铜的基础细胞培养基的最终铜浓度是2.4 μ g/L至20 μ g/L铜。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中补充所述基础细胞培养基的铜以铜盐、铜螯合物或它们的组合的形式提供。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述铜盐选自:硫酸铜、醋酸铜、碳酸铜、氯化铜、氢氧化铜、硝酸铜和氧化铜。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述一个或多个细胞是哺乳动物细胞。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中培养所述一个或多个细胞包括:所述细胞的分批培养。15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中培养所述一个或多个细胞包括:所述细胞的连续培养。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞的连续培养以恒化模式进行。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞的连续培养以灌注模式进行。18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在至少IOOL所述经补充的基础细胞培养基中培养所述一个或多个细胞。19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在培养所述一个或多个细胞的步骤过程中，将细胞密度维持在小于2.5xl06个细胞/mL。20.根据权利要求19所述的方法，其中在培养所述一个或多个细胞的步骤过程中，将所述细胞密度维持在小于2.0xlO6个细胞/mL。21.根据权利要求19所述的方法，其中在培养所述一个或多个细胞的步骤过程中，将所述细胞密度维持在小于1.5xl06个细胞/mL。22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述回收培养物上清液的至少一部分的步骤包括过滤或离心，...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·格里尔贝格尔，M·赖特尔，W·蒙特，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特保健股份有限公司，
类型：
国别省市：